151985. lajstromszámú szabadalom • Eljárás demetiltetraciklinek előállítására új Streptomyces törzzsel
151985 és 50 y/ml ametopterint tartalmaz — tenyésztjük ki. Az utódok közül többnél magasabb demetilklórtetraciklin termelés volt megfigyelhető, például a BDM—2816 jelű törzsnél 40%. 5. A DM—14 törzs desztillált vizes spóra- 5 szuszpenzióját — mely 104 /ml spórát tartalmaz —• ismert módon Röntgen-sugárral besugározzuk, 40 000 r dózisban, a túlélőket az 1. példa szerinti szilárd spóráztató táptalajon — mely 75 y/ml 2-(p~aminobenzol-szulfonil)-4-metil-tia- 10 zolt és 50 y/ml aminopterint tartalmaz — tenyésztjük ki. Az utódok közül többnél magasabb demetilklórtetraciklin termelés volt megfigyelhető, például a CDM—2114 jelű törzsnél mintegy 55%. 15 6. A Streptomyces aureofaciens CDM—2114 törzs 2 ml vizes spóraszuszpenziójával (107 /ml spóra) beoltunk 100 ml inokulum-táptalajt (500 ml-es Erlenmeyer lombikban), melynek összetétele: keményítő 2,0%, kukoricalekvár 2,0% 20 (szárazanyagban), CaC03 0,4%, pálmaolaj 0,2%; pH = 6,8, sterilezés után. Beoltás után excenteres rázóasztalon (rázatási sebesség 200/perc), 27 C°-on tenyésztjük 40 óráig. A kifejlődött oltóanyag 2 ml-ével oltunk 80 ml fermentációs 25 táptalajt (500 ml-es Erlenmeyer-lombikban), melynek összetétele a következő: keményítő 3,5%, kukoricalekvár 0,6% (szárazanyagban), extrahált napraforgódara 0,7%, NH4 NO s 0,6%, KN03 0,20/o, KCl 0,20/o, CaC03 0,6%, pálmaolaj 30 0,5%. A pH sterilezés után 6,2. Beoltás után excenteres rázóasztalon (rázatási sebesség 200/ /perc), 27 C°-on tenyésztjük, 72 óráig. Ekkor a fermentlé 1310 mcg/ml demetilklórtetraciklint, 730 mcg/ml klórtetraciklint és 180 mcg/ml tetra- 35 cikiint tartalmaz, 7. A 6. példa szerint elkészített oltóanyag 300 ml-ével beoltunk 6 liter fermentációs táptalajt (12 literes üvegfermentorban), a következő öszszetételben: keményítő 2,0%, kukoricaliszt 4,0%, 40 kukoricalekvár 1,2% (szárazanyagban), extrahált napraforgódara 0,8%, NH4 N0 3 0,8%, KN0 3 0,3%, KCl 0,20/o, CaC03 0,8%, pálmaolaj 0,5%. A pH sterilezés után 6,2. Beoltás után 27 C°-on, 640 fordulat/perc keverés, 6 liter/perc levegőz- 45 tetés mellett 60 órán keresztül fermentálunk. Ekkor a fermentlé 2090 y/ml- demetilklórtetraciklint, 1470 y/ml klórtetraciklint és mintegy 250 y/ml tetraciklint tartalmaz. 8. A 6. példa szerint előállított oltóanyag 300 50 ml-ével beoltunk 6 liter, a 7. példa szerinti fermentációs táptalajt. Beoltás után a 3., 6., 9., 12., 15., 18., 24. órákban — steril körülmények között — a fermentiere nézve 50, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500 y/ml, összesen 9,0 g p-amino- 55 -benzolszulfonilguanidint adagolunk a fermentációhoz. A fermentációs körülmények egyébként azonosak a 7. példában leírtakkal, 60 órás fermentálás után a fermentlé 2,810 y/ml demetilklórtetraciklint, 740 y/ml klórtetraciklint 60 és 100 y/ml tetraciklint tartalmaz. 9. A 6. példa szerint előállított oltóanyag 300 ml-ével beoltunk 6 liter, a 7. példa szerinti fermentációs táptalajt. Beoltás után a 3., 6., 9., 12., 15., 18., 24. órákban — steril körülmények kö- 6 5 zött — a fermentiere nézve 6, 13, 30, 55, 80, 110, 165 y/ml tehát összesen 990 mg 2-(p-amino~benzolszulfonil)-4-metil-tiazolt adagolunk a fermentációhoz. Egyéb fermentációs körülmények azonosak a 7. példában leírtakkal. 60 órás fermentálás után a fermentlé 2510 y/ml demetilklórtetraciklint, 680 y/ml klórtetraciklint és mintegy 100 y/ml tetraciklint tartalmaz. 10. A 6. példa szerint előállított oltóanyag 300 ml-ével beoltunk 6 liter szintetikus fermentációs táptalajt, a következő összetételben: keményítő 4,5%, NH4NO3 0,80/0 , KNO3 0,2%, MgS0 4 0,1%, KH2 P0 4 0,05%, CaC0 3 0,6%, MnS0 4 0,003%, ZnS04 0,01%, FeS04 0,001%, glutaminsav 0,1%, pálmaolaj 0,3%. A táptalaj ionmentes vízzel készül. A pH sterilezés után: 6,2. Beoltás után 27 C°-on, 640 fordulat/perc keverés, 6 liter/perc levegőztetés mellett fermentálunk. A fermentáció 3., 6., 9., 12., 15.,, 18., 24. óráiban a fermentiere vonatkoztatva 25, 50, 120, 240, 360, 500, 700 y/ml-nek megfelelő, összesen 4,2 g p-amino-benzolszulfaniíguanidint adagolunk a fermentléhez. 60 órás fermentálás után a fermentlé 1210 y/ml demetiltetraciklint, 350 y/ml tetraciklint és mintegy 100 y/ml demetilklórtetraciklint tartalmaz. 11. A 6. példa szerint előállított oltóanyag 300 ml-ével oltunk 6 liter szintetikus fermentációs táptalajt, mely a 7. példa szerint készül, és 0,6% KBr-dal van egészítve. Beóltás után a 7. példa szerinti fermentációs körülmények között és adagolás mellett folytatjuk le a fermentációt. 60 órás fermentálás után a fermentlé 980 y/ml demetilbrómtetraciklint és 490 brómtetraciklint tartalmaz. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás demetiltetraciklinek előállítására Streptomyces nemzetségbe tartozó törzs levegőztetett, szubmerz fermentációja útján, amelyre jellemző, hogy a fermentációt metionin bioszintézisében deficiens törzsek fólsav antagonista jelenlétében történő gén-rekombinációjával előállított prototróf törzzsel, vagy annak utódjával, variánsával, illetve mutánsával végezzük el. 2. Az 1. igénypontban ismertetett eljárás foganatosítási módja, amelyre jellemző, hogy fólsav antagonista faktorként aminopterint és/vagy ametopterint alkalmazunk, előnyösen 5—500 y/ml mennyiségben. 3. Az 1—2. igénypontban ismertetett eljárás foganatosítási módja, amelyre jellemző, hogy további fólsav antagonista faktorként H2 N-< ^>— S02 -NH-R általános képletű (ahol R jelentése alkil, aril, aralkil, cikloalkil, heterociklus, vagy szénsavszármazék-) szulfonamidokat is alkalmazunk, előnyösen 5—5000 y/ml mennyiségben.
