151985. lajstromszámú szabadalom • Eljárás demetiltetraciklinek előállítására új Streptomyces törzzsel
151985 3 4 E biokémiai mutánsokkal végezve a gén-rekombinációt — különleges körülményeket biztosítva a gén-rekombináció lefolyására — az előállított prototrof rekombinánsok között található olyan egyed, amelynél normális cisztein-metionin bioszintézis mellett a tetraciklin-váz C6 helyén történő metilezés genetikailag gátolt. Minthogy a metilezés az általános anyagcserében és általában a Ci anyagcsere érintetlen e prototrof rekombinánsoknál, az előállított törzseknél e genetikai blokk nem eredményezi a demetiltetraciklinek kizárólagos bioszintézisét, a tetraciklin molekula C6 helyén a metilcsoport bevitele más konstitucionális enzimek által is létrejöhet — ha kisebb sebességgel is — mint a tetraciklin váznak a bíoszintézise. Az előállított prototrof rekombinánsok között találunk olyanokat, melyek feltűnően magas százalékban termelnek demetiltetraciklineket. A prototrof rekombinánsok előállításához, a gén-rekombináció létrejöttéhez különleges feltételeket biztosítunk. A gén-rekombináció mint jelenség, a Streptomyceseknél általánosan ismert G. Sermonti és I. Spada-Sermonti felfedezése óta (Nature 176, 121, 1935.) és számos Streptomyces fajnál megfigyelték D. H. Braendle, W. Szybalsky: Proc. Natl. Acad. Sei. US 43, 147, 1957.; H. Saito, Y. Ikeda: Microbiol. Gen. Bull. 15, 25, 1957.; I. Alikhanyan, S. Z. Mindlin: Nature 180, 1208, 1957.; M. Járai: Acta Microbiol. Acad. Sei. Hung. 7. 197, I960.). Jelen eljárás kidolgozásánál az általunk már korábban alkalmazott módszert használjuk (M. Járai: Acta Microbiol. Acad. Sei. Hung. 8, 73, 1961.), azonban a találmányra vonatkozó hipotézisünk alapján olyan körülményeket biztosítunk, hogy demetiltetraciklineket termelő törzsek — gyakorlatilag biztosan — keletkezzenek. E cél elérésére a gén-rekombináció létrejöttekor fólsav antagonistákat alkalmazunk, így aminopterint (4-aminopteroil glutaminsav) és ametopterint (4-amino-10-metil-pteroil-glutaminsav) előnyösen 5—500 yjml mennyiségben, továbbá szulfonamidokat adagolunk a táptalajba, amelyen a gén-rekombináció lezajlik. Szulfonamidként I. képletű vegyületeket alkalmazhatunk (ahol R jelentése szerves gyök) 5—5000 y/ml mennyiségben. Előnyösen 50— 5000 7/ml p-amino-benzolszulfonilguanidint és/ /vagy 50—500 yjral 2-(p-ammobenzolszulfonil)-4-metiltiazolt és/vagy 10—1000 y/ml 2-(p-aminobenzolszu]fonil)-4,6-dimetil-pirimidint és/vagy 10—1000 y/ml 2-(p-aminobenzolszulfonil)-6-metoxi-piridazint alkalmazunk. Jelen találmány szerint készült prototrof rekombinánsok egyikét, a CDM—2114 jelű törzset — összefoglalva — a következő módon állítottuk elő: N—4 (meth") N—6 (arg - cys"~) 4- Y gén-rekombináció (100 y/ml ametopterint tartalmazó 1. példa szerinti „minimális" spóráztató táptalajon, kiegészítve 10 7 M 1-metioninnal, 10 " 8 M 1-argininnel és 5 • 10~6 M 1-cysteinnel) r DM—14 (átizolálva az 1. példa szerinti szilárd spóráztató táptalajra) •"• a DM—14 törzs vizes spóraszuszpenziójának Röntgen-sugárzása, 40 000 r egység 4-a besugárzott spóraszuszpenzió szélesztése szilárd spóráztató táptalajra, mely 75 y/ml ultraszeptilt és .50 //ml aminopterint tartalmaz CDM—2114 (fenntartása szilárd spóráztató táptalajon, 1. példa szerint). A keletkezett prototrof rekombinánsokat demetil-tetraciklinek termelésére vizsgálva azt találtuk, hogy közülük több rekombináns esetében magas össz-tetraciklin termelés mellett nagy százalékban keletkeznek a tetraciklinek demetil-analógjai. A fent ismertetett módszerrel előállított CDM—2114 jelű törzs 50—60% demetilklórtetraciklint, és 40—50% klórtetraciklint, (valamint nyomokban tetraciklint) termel, az össz-tetraciklin termelés 4000 E/ml, a példákban ismertetett fermentációs körülmények között. A fermentációhoz felhasznált táptalaj szénforrásként keményítőt, kukoricalisztet, szerves nitrogén forrásként pedig kukoricalekvárt, extrahált napraforgódarát, kukoricalisztet, mogyorólisztet, vagy élesztőextraktot tartalmaz.. Fentieken kívül ammóniumsókat, előnyösen kloridot, szulfátot, vagy nitrátot, valamint káliumsókat, kalciumsókat, és magnéziumsókat, előnyösen káliumkloridot, kalciumkarbonátot, magnéziumkloridot, vagy magnéziumszulfátot is adunk a táptalajhoz. A fermentációt 25—35 C°-on, előnyösen 27 C°-os hőmérsékleten hajtjuk végre. Eljárhatunk oly módon is, hogy kezdetben 25—26 C°-on fermentálunk, majd a fermentáció végén 30—32 C°-ra emeljük a hőmérsékletet. A fermentáció időtartama 45—75, előnyösen 50—60 óra. A találmányunk tárgyát képező eljárás további alapját az a felismerés képezi, hogy a tetraciklinek bíoszintézise, közelebbről az aktív metilezés időpontjának kezdete, a fermentációnak csak egy bizonyos — bár korai — szakasza után következik be. Az eddig ismeretes fermentációs eljárások folyamán az inhibitort egyszerre adagolták a fermentáció kezdetén és ez többek között a protein-anyagcserére káros hatást gyakorol, melynek egyik következménye-10 15 20 25 30 35 40 45 50 5Z 60 2
