151785. lajstromszámú szabadalom • Eljárás lizergsavszármazékok előállítására
151785 E gomba mintáit az United States Department of Agriculture (Northern Utilization Research and Development Division), Peoria, 111. intézeténél letétbe helyeztük NRRL 3027 szám alatt. A Claviceps paspali Stevens et Hall eddig leírt törzseivel ellentétben az NRRL 3027 törzs sklerotiumai alkaloidtartalmúak. E sklerotiumminták alkaloidtartalma 0,04% volt és az alábbi összetételt mutatta: lizcrgsavamid 40% izolizergsavamid 20% ergobazin 15% ergobazinin 10% chanoklavin 10% ismeretlen 5% 10 15 20 25 Az alkaloidelegyet papírkromatográfiai módszerrel elemeztük, az egyes alkotórészek százalékarányát a színfoltok intenzitása alapján határoztuk meg. ! A fenti új gombatörzs elkülönítése és szaporítása az alábbi módon történik: Egy sklerotium belsejéből steril körülmények között egy kis szövetdarabot veszünk ki és ezt sör-malátalé-ágárra visszük át (a malátalé-ágár összetétele 250 ml komlózatlan világos malátáié, 17% szárazanyagtartalommal, 18 g agár, desz- 30 tillált vízzel 1 literre feltöltve, pH = 5,2). Kerek kolónia fejlődik, amely 24 C° hőmérsékleten történő 14 napi inkubálás után 15 mm átmérőjűre növekszik. Ez a kolónia egy az agár felületén felfekvő kb. 1 mm vastag, pszeudo-sklerotiális szerkezetű bőrszerű rétegből és efölött egy fehér levegőmicélium-párnából áll. A kolóniából az agárba egy barna színezőanyag diffundál be. Konidiumok nem képződnek. : '.ifi Ezt a kolóniát spatulával darabokra osztjuk és egy kehelypohárban levő 12 ml alábbi öszszetételű ágáros táptalajra visszük át: 35 40 vonódott egy finom fehér micéliummal, 10 nap múlva pedig egy barnásszürke, finoman ráncolt micélium-takaró fejlődött ki, amely szorosan felfekszik az agáron és csak rövid levegőhyphákat képez. Ez utóbbiakon konidiumok fűződnek le. 12,nap múlva a micéliumban különböző helyeken központok alakulnak ki, amelyeken egy vörösesbarna folyadék apró cseppecskéi választódnak ki. Ezek a cseppecskék 1—3 mm átmérőt érnek el és rövidesen tejszerűen megzavarosodnak az igen nagyszámú konidiumtól. 16—18 nap múlva a konidiumképződés gyakorlatilag befejeződött. Egy 12 ml ágáros táptalajt tartalmazó, 2 cm átmérőjű kémcsőben nevelt ferde ágáros kultúra kb. 108 konidiumot tartalmaz. . Az alámerülő kultúrában történő tenyésztés céljaira először egy előkultúrát nevelünk az alábbi módon: Tápközegként 4,5%-os vizes malátakivonatoldatot alaklmazunk, amelynek pH-értéke 5,4. 1 liter ilyen oldatot egy kétliteres Erlenmeyerlombikban 20 percig sterilizálunk 110 C° hőmérsékleten, majd az új-guineai törzs egyspórás mutánsának 20 napos ágáros kultúrájából vett 5 • 108 konidiummal beoltjuk és forgó rázógépen 3 napig inkubáltatjuk 23 C° hőmérsékleten. Finom micélium-pelyhekből álló sűrű kultúrát kapunk. A pelyhek laza hypa-csomókból állnak, átmérőjük 2—4 mm. Alkaloidok ezekben nem mutathatók ki. Nagyobb mennyiségű előkultúra nyerése céljából üveg-fermentorokban 10—10 liter ugyanilyen összetételű tápközeget oltunk be. egyenként 5 • 109 konidiummal és 3 napig inkubáltatjuk 23 C° hőmérsékleten, percenként 6 liter levegővel szellőztetve és percenként 200 fordulattal keverve a tápközeget. A habzás-leküzdésére szilikon-emulziót alkalmazunk. Az így kapott fermentoros kultúrák ugyanolyan tulajdonságokat mutatnak, mint a rázott kultúrák. A főkultúra céljaira különösen előnyösnek bizonyult az alábbi összetételű tápoldat: malátáié kukoricalekvár-szárazanyag tejsav ammóniaoldat 4,8 pH-értékig agár desztillált víz 45 500 ml szorbit 50 g 60 g borostyánkősav 36 g 1 ml KH2 PO., . 2 g MgS04 0,3 g 20 g 50 FeS04 1 mg-7H2 0 1 literre. ZnS04 10 mg-7H2 0 Minegyik inokulum-darab körül egy először fehér, később vörösbarnára színeződő micéliumból álló kis kultúra fejlődik ki. 10 nap múlva konidiumok kezdenek lefűződni a hyphd-csűcsokon. 20 nap múlva már elegendő mennyiségű konidium képződött ahhoz, hogy vizes konidium-szuszpenziót állítsunk elő, amellyel 20 ferde ágáros kémcsövet (a fenti összetételű ágáros táptalajjal) olthatunk be. Ezeket a kultúrákat 24 C° hőmérsékleten inkubáltatjuk. A konidiumok 24—36 óra múlva csíráznak. 6 nap múlva az agár felülete már egyenletesen be-55 60 65 1 liter desztillált vízben, ammóniával 5,4 pH-értékre beállítva. A cink- és vasionoknak a gomba fejlődésére és a közeg alkaloidtartalmára gyakorolt befolyását az alábbi két táblázat szemlélteti: 1. Fejlődés g/liter száraz micéliumban kifejezve: FeS04 • 7H2 0 mg/literben 0 1 10 ZnS04 • 7H 2 0 mg/l-ben 7,2 4,2 6,1 11,6 6,1 17,1 2
