151420. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteolitikus enzimek előállítására

3 151420 4 volt kimutatható; számos más Aspergillus és 'néhány Penicillium faj szintén ilyen típusú enzimet termel. A különböző proteolitikus enzimeknek az optimális enzim-aktivitás pH-tartománya alapján történő osztályozása és jellemzése azonban nem kielégítő. Különféle eredetű enzimek egyszerű táptalajokon hasonló hatást mutathatnak, annak ellenére, hogy maguk az illető enzimek lényegesen eltérő természetűek. Ezért néhány kutató kísérletet tett a proteolitikus enzimeknek a különféle proteolízis-gátló szerekkel szembeni viselkedésük alapján történő osztályozására. Ügy vélték, hogy ezen az alapon különbséget lehet tenni az egyes, egyszerű táptalajokon azonos hatást mutató proteolitikus enzimek között. Ilyen alapon valóban részletesebben lehetett a proteolitikus enzimeket osztályozni és lehetségesnek bizonyult egyes eddig tiszta, egységes anyagnak tartott enzimkészítmények több különböző enzimből álló voltát kimutatni. Minthogy a proteáz enzimek specifikusságára vonatkozó ismereteink még ma sem mondhatók tavairól sem teljeseknek, kísérletet tettek az ilyenfajta enzimek más alapokon történő osztályozására is, ezek a kísérletek sem vezettek azonban eddig kielégítő eredményre. Bár a proteolitikus enzimeket már 1932 óta széles körben vizsgálták, a reájuk vonatkozólag hozzáférhető adatok legynagyobbrészt nyers, frakcionálatlan és részben inaktíyált készítményekre vonatkoznak. Viszonylag kevés esetben történt kísérlet az egyes különböző enzimek abszolút és viszonylagos mennyiségeinek meghatározására. A penészgombák által termelt proteolitikus enzimek száma igen nagynak látszik, reájuk vonatkozó ismereteink azonban jóval szegényesebbek, mint az állati eredetű enzimekre vonatkozóké. Annyit minden esetre sikérült megállapítani, hogy az enzimtartalom ugyanolyan penészgomba-fajok egyes tagjai között is éppen annyira ingadozó, mint a- különböző fajokhoz tartozó penészgomba-kultúrák között. A penészgombák szaporítására alkalmazott tápközegnek és. az inkubáció időtartamának is lényeges hatása van a képződött enzimek menynyiségére. A penészgomba-proteázokra vonatkozó vizsgálatok viszonylag hiányos volta feltehetően szorosan összefügg azzal a körülménnyel, hogy az egyes különböző ilyen enzimek elkülönítése és frakcionálása igen nagy gyakorlati nehézségekkel jár. A proteázok elkülönítésére már számos módszert javasoltak, ezek legtöbbje azonban különböző hátrányokat mutat. Az egyes enzimek tisztítása is igen nehéz és bonyolult problémákkal jár. Egyes proteolitikus enzimek kevéssé stabilak és könnyen elvesztik aktivitásukat; így az ilyen enzimek tisztítását igen nagy gonddal, különleges, szigorúan meghatározott körülmények között kell végezni. Emellett további lényeges problémák származnak abból a tényből, hogy mindegyik fajta en„zim csak bizonyos korlátozott körülmények között stabil és a stabilitás feltételei enzimről enzimre változnak. Ezért mindegyik enzim esetében másfajta követelmények merülnek fel a megfelelő hatásfokú és jó hozamú tisztítással szemben; általános gyakorlati módszerek csak ritkán alkalmazhatók. Ezek a szokásos tisztítási módszerek emellett rendszerint azt eredményezik, hogy a proteáz " enzimekkel együtt bizonyos tisztátalanságok is felhalmozódnak a készítményekben. Ezért kielégítő tisztítási hatásfok érdekében a tisztítást szigorúan meghatározott feltételek mellett kell végezni, ami viszont számottevő mértékben csökkenti az egyes proteázok hozamát. A jelen találmány egyik tárgy át. a mikrobiológiai módszerekkel termelt proteáz-enzimek elkülönítése és tisztítása képezi. A találmány további tárgya oly eljárás biztosítása a proteolitikus enzimek elkülönítésére és tisztítására, amely nem eredményez számottevő csökkenést az enzim hozama és aktivitása terén. A találmány egyik további tárgya oly készítmények előállítása, amelyek a fertőzött, rosszul gyógyuló sebek gyógykezelésére, valamint a vénákban és artériákban — többek között az agy és a szív ereiben — fellépő véralvadékok és zárványok oldására alkalmasak. A találmány további tárgyát oly készítmény előállítása képezi, amely a vaszkuláris rendszerben fehérje vagy más jellegű anyagok kiválása által okozott rögök és egyéb akadályozó lerakódások feloldására és eltávolítására alkalmazható. A találmány további célkitűzései és előnyei az alábbi leírásból tűnnek ki. A találmány szemléltetésére szolgálnak a csatolt rajzok is, amelyeken az alábbiak láthatók: Az 1. A ábra a nyers proteáz-elegy zselatináz-aktivitását mutatja, a pH-érték függvényeként; az 1. B ábra a nyers proteáz-elegy hemoglobináz-akti vitását mutatja, a pH-érték függvényeként; az 1. G ábra a nyers proteáz-elegy kazeinázaktiviíását szemlélteti, a pH-érték függvényeként; a 2. ábra a nyers proteáz-elegy dietilaminoeti-eellulózon (DEAE-cellulóz) történő kromatografálása során kapott frakcionálási görbét mutatja. Ezen az ábrán a folytonos vonal a 280 núllimikronriál mutatott fény abszorpciót képviseli. A sraffozott terület a 6,0 pH-értéknél mutatott viszonylagos kazeináz-akíivitásnak felel meg. A> 3. ábra a különböző proteázok (I, II és III protéáz) karboximetilcellulózon való adszorbeálódását mutatja a pH-érték függvényeként; az adszorpció teljességét az oldat kazein-aktivitásának 6,0 pH-érték-en mutatott megváltozása alapján határoztuk meg: 0 o o I proteáz __o——o o- II proteáz —-—A- A A III proteáz 10 1? 20 25 30 35 40 45' 50 55 60 2