151420. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteolitikus enzimek előállítására

5 A 4. ábra a karboximetilcellulózon történő szelektív adszorpció és az elválasztás kiviteli módját szemlélteti vázlatosan. •A jelen > találmány tárgyát képező proteáztisztítási . módszerek különféle penészgombák 5 szaporítása által kapott fermentlevek proteolitikus enzimjeinek elkülönítésére és elválasztására alkalmazhatók. ~A proteolitikus enzimeket a találmány értelmében oly módon választjuk szét és külö- 10 nítjük el, hogy a proteázok előzetesen esetleg már tisztított oldatát egy karboximetilcellulózból vagy karboximetildextránbóí álló ioncserélővel (pl. CM-Sephadex, Pharmacia) hozzuk 2,5 és 8,5 közötti pH-tartományban érintkezésbe, 15 majd az így adszorbeált proteázokat oly módon eluáljuk, hogy az ioncserélő anyagot az adszorbeálás során alkalmazott pH-értéknél magasabb pH-értékre puff erezett eluáló-oldattal hozzuk érintkezésbe. 20 A találmány szerinti eljárás egyik kiviteli alakja esetében kiinduló anyagként oly proteázokat alkalmazunk, amelyeket az Aspergillus, Pénicillium és Rhizopus fajú penészgombák tenyésztése útján nyertünk. 25 A penészgombák tenyésztése útján kapott proteáz-tartalmú oldatot a találmány egy másik előnyös kiviteli alakja értelmében ^előzetesen tanninnal kezeljük, amikor is egy csapadékot kapunk, amelyből azután a tannint valamely 30 erre alkalmas oldószerrel történő extrakció útján távolítjuk el. A találmány egy másik előnyös kiviteli alakja esetében a későbbiekben közelebbről körülírandó tulajdonságú proteolitikus enzimeket, 35 amelyeket itt „I proteáz", „II proteáz" és „III proteáz" néven említünk, oly módon választjuk el egymástól, hogy az Aspergillus oryzae' alámerülő kultúrájának a sporuláció megkezdődéséig folytatott tenyésztése útján kapott és le- 40 szűrt fermentlevet előzetes tisztításnak vetjük alá, a jelenlevő fehérjéknek, közöttük a proteázoknak is, tanninnal történő lecsapása útján. A tannint ezután acetonnal eltávolítjuk, a maradékot vízben oldjuk, az oldat pH-értékét 5,0- 45 ra állítjuk be és az így kapott proteáz-tartalmú oldatot kationcserélő karboximetilcellulózzal hozzuk érintkezésbe, amelyét ugyanilyen pH-értékre állítottunk be. A karboximetilcellulózt azután a rajta adszorbeált I proteázzal együtt 50 elkülönítjük az oldattól, az oldatot 4;5 pH-értékre állítjuk be és ugyanilyen pH-értékre beállított karboximetilcellulózzal hozzuk érintkezésbe, majd ezt a karboximetilcellulózt a rajta adszorbeált II proteázzal együtt elkülönítjük az 55 oldattól, amelyet azután a III proteáz elkülönítése céljából 3,0 pH-értékré állítunk be és ismét ugyanilyen pH-értékre beállított karboximetilcellulózzal hozunk érintkezésbe,, majd ezt a karboximetilcellulózt is, a rajta adszorbeált 60 III proteázzal együtt elkülönítjük az oldattól; a tiszta I, II és III proteázokat azután különkülön eluáljuk a megfelelő kationcser élő anyagról, olyan oldatokkal való mosás útján, amelyeket , magasabb pH-értékre állítottunk be 65 6 puffer segítségével, mint amilyenen az illető proteáz adszorbeáltatása történt. A jelen találmány kiterjed magukra az ily módon tisztított I proteáz, II proteáz és III proteáz proteolitikus enzimekre is, amelyek az alábbi jellemző tulajdonságokat mutatják: I. proteáz: egy egységes fehérjéből álló proteolitikus enzim, amely aktív a fibrinnel, fibrihogénnel, kazeinnel, zselatinnal és hemoglobinnal szemben; az enzim részlegesen gátolható szérum-inhibitorral, nem gátolható szójainhibitorral; a 4,0 és 9 közötti pH-tartományban stabil; a 6,5 és 10,0 közötti pH-tartományban mutat aktivitást, mimellett maximális aktivitása 8,0 pH-értéknél van; optimális hőmérséklete 47 C°; 0,7—0,9 milliekvivalens karboxilcsoportot grammonként tartalmazó karboximetilcellulózon 5,5 pH-értéken, 0,01 mólos foszfáttompító oldatból adszorbeálódik és 7,0 pH-értéken 0,05 mólos foszfát-tompítóoldattal eluálható arról. II. proteáz: egy egységes fehérjéből álló proteolitikus enzim, amely a fibrinnel, fibrinogénaél, kazeinnel, zselatinnal és hemoglobinná! szemben aktív; szérum-inhibitorral részben gátolható, szója-inhibitorral nem gátolható; a 4,0 éá 10,5 közötti pH-tartományban stabil; a 3,5 és 11 közötti pHf-tartományban mutat aktivitást, mimellett maximális aktivitása 6,3 pH-értéknél van; optimális hőmérséklete 50 C°: 0,7— 0,9 miÜiekvivalens/g karboxilcsoportot tartalmazó karboximetilcellulózon 4,5 pH-értéknél adszorbeálódik 0,01 mólos foszfát-tompítóoldatból és 0,05 mólos foszfát-tompítóoldattal eluálható arról. III proteáz:: égy egységes fehérjéből álló proteolitikus enzim, amely fibrinnel, fibrinogénnel, kazeinnel és hemoglobinnal szemben aktív; szérum-inhibitorral gátolható, szója-inhibitorral azonban nem; a 2,3 és 6,5 közötti pH-tartományban stabil; a 2,0 és 11,0 közötti pH-tartományban mutat aktivitást, mimellett maximális aktivitása 5,0 pH-értéknél van; optimális hőmérséklete 42 C°; 0,7—0,9 milliekvivalens/g karboxilcsoportot tartalmazó karboximetilcellulózon 3,0 pH-értéknél adszorbeálódik 0,01 mólos foszfát-tompítóoldatból és 6,0 pH-értéknél 0,05 mólos foszfát-tompítóoldattal eluálható arról. A találmányt az alábbiakban az Aspergillus oryzae kultúrából kapott enzimek tisztításának, vizsgálatának és klinikai alkalmazásának leírásával szemléltetjük. Ez a leírás nem kívánja a találmányt erre a megadott példára korlátozni, csupán a találmány egyik előnyös kiviteli alakját van hivatva közelebbről szemléltetni. Az alámerülő kultúrából kapott nyers proteáz-oldat a proteázok és egyéb enzimek mellett különféle szennyezéseket, mint nagymolekulájú szerves anyagokat, pl. poliszacharidokat, glukop.roteineket, nukleoproteineket, továbbá színező anyagokat stb. tartalmaz, amelyek a felhasznált mikroorganizmusok anyagcsere- és autolízistermékei; emellett kismolekulájú szennyezések is jelen vannak, mint pl. a tápközegből szár*