150556. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nyers heparin tisztítására
2 150.556 komplexet bizonyos ionkoncentráció alkalmas megválasztásával bontják meg. Ilyen eljárást ismertet a 2,623.001 számú amerikai szabadalom, —• ami egy kíméletes úton, fehérje , denaturálást elkerülő módszerrel előállított fehérje-heparinkomplexet úgy bont meg, hogy ennek oldatához pH 6,5 és 10 között olyan sómennyiséget ad, mely elegendő a protein kisózással történő kicsapásához. A heparin a fehérjék nagy részétől így megszabadítva, a sós, vizes oldatban marad. Az eljárás azonban csak a különlegesen kíméletes körülmények között, iparilag rentábilisán elő nem állítható natív heparin-protein-komplex feldolgozására alkalmas, így ipari alkalmazásban nem terjedt el. Az elektrolit koncentráció és a pH együttes változtatásával választja el a heparintól a fehérjét a 2,797.184 számú amerikai szabadalomban leírt eljárás. Ez a módszer a használatos ipari eljárásokkal előállított, tehát denaturált fehérjéket tartalmazó komplex megbontására alkalmas és úgy jár el, hogy az ismeretes módom előállított, savas lecsapással kinyert fehérje-heparin-komplexet lúgosítással vizes oldatba viszi (pH 10 és pH 7 között), majd annyi vízoldható sót ad az oldathoz, hogy annak koncentrációja 1 mol/liternél nagyobb legyen. Az oldat megsavanyítása után (pH 2,5—4 között) fehérje csapadék válik le, míg a heparin oldatban marad. így a fehérjék nagy részétől megtisztított sós, vizes oldatot nyer, aminek savas kémhatását ismét semlegesíti, majd két. térfogat etilalkohol hozzáadásával kicsapja a hatóanyagot. Az idézett szabadalom szerint bármely vízoldható sóval elő lehet állítani a megfelelő sókoncentrárációt, viszont összes példáiban és igénypontjaiban hangsúlyozza, hogy .a tisztítandó savas heparin-protein-komplexet előbb lúgos pH mellett oldatba kell vinni és a lúgos oldatban kell beállítani, tetszés szerinti só beoldásával, a megfelelő ionkoncentrációt. Ezután kell a lúgos sós oldat megsavanyításával lecsapni az inert fe hérjét, majd az ettől elválasztott savanyú-sós szupernatánst ismét visszásemlegesítve, két térfogat alkohol hozzáadásával kicsapható a megtisztított heparin, nagy mennyiségű só kíséretében. Vizsgálataink során megállapítottuk, hogy az ionkoncentráció befolyását felhasználó ismert fehérje eltávolítás! módszerek — bár lényeges haladást jelentenek a nehézkes proteolízises módszerrel szemben, mégsem optimálisak. Eltekintve a többszöri pH-változtatás és a heparinnal esetleg együtt kicsapott só miatt szükséges dialízis műveleteitől, lényeges hiányosságai vannak mind a kitermelésben, mind a nyert termék minőségében, valamint az ipari kivitelezhetőségben is. A technológiai kivitelezést az nehezíti meg, hogy a heparin-protein-komplex lúgos feloldását és a só hozzáadását követő savas lecsapás után a heparint tartalmazó szupernatáns általában opálos vagy zavaros marad és ilyen esetben hosszas centrifugálással sem sikerül megtisztítani; így az ebből kicsapott heparinban is sok, túlnyomórészt lipoproteidekből álló inert szennyeződés marad, a kitermelést viszont rontja, hogy a fehérjecsapadékban is jelentékeny mennyiségű heparin marad vissza. Az általunk kidolgozott eljárásban ezek a hiányosságok és nehézségek nem jelentkeznek. Az eljárásnalT’lényege az, hogy az ismert módszerekkel előállított nyers léből a szokásos savas kicsapással nyert csapadékot — ellentétben az eddig ismeretes eljárásokkal — nem visszük lúgosítással oldatba, hanem olyan extrakciónak vetjük alá, ami a heparint úgy oldja ki, hogy az oldat tükrösen tiszta legyen és mentes nemcsak a fehérjéktől, hanem a lipoidoktól is. A művelet a savas csapadék eredeti, 2—3 közti pH-értéke mellett történik és a heparint tartalmazó kivonatot is a változatlanul hagyott savanyú pH értéke mellett csapjuk ki alkohollal. A találmány értelmében a heparin kivonatolását olyan vizes eleggyel végezzük, mely egyrészt annyi vízoldható szervetlen sót tartalmaz, hogy a teljes extrakciós elegyben a só-koncentráció 7—12% legyen, másrészt a teljes térfogat 0,5—2 térfogatszázalékát kitevő, víznél nehezebb és azzal nem elegyedő szerves zsíroldószert, — általában klórozott szénhidrogént tartalmaz, amit célszerűen 10—20% vízzel elegyedő szerves oldószerben — általában alkoholban oldva keverünk az extrakciós elegyhez. A kivonatoló elegy két komponensét, a vizes és oldószeres részt összekeverhetjük, vagy különkülön adagolhatjuk az extrahálandó savas fehérje csapadékhoz. Az eljárás egyszerű kiviteli módja az. hogy a centrifugából (szeparátorból) kiszedett savas csapadékhoz hozzáadunk centrifuga-nedves súlyának egyötöd részét kitevő triklóretilént, tízszeres mennyiségű alkoholban oldva és alapos homogenizálás közben hozzáfolyatunk a csapadék súyának tízszeresét kitevő mennyiségű 11%-os konyhasó oldatot. V2 órai keverés után a magárahagyott savas elegy gyorsan ülepedik, dekantálás után a csapadékos részt centrifugán tömöri tjük és 10% sót tartalmazó olyan vízzel mossuk ki, amihez hozzáadtunk 20 térfogatszázalék alkoholban oldott 2 térfogatszázalék triklóretilént. Az összegyűjtött víztiszta szupernatánsok térfogatát lemérjük, hozzáadunk 1,3 térfogat alkoholt, amelynek hatására leválik a hatóanyag, sószennyeződés nélkül, lényegesen jobb kitermeléssel és nagyobb tisztaságban, mint amit az eddig ismeretes eljárásokkal el lehetett érni. Az eljárás egszerűbb, mint az eddig ismeretes módszerek és jól alkalmazható akkor is, ha • a nyers léből savas kicsapással kapott heparinfehérjéből álló üledéket a centrifugálás műveletének az ismeretes peptizálásából eredő veszteség elekr ülése érdekében nem tömő rí tjük, hanem a teljes üledék térfogatában akarjuk a fehérjementesítésnek alávetni. Mivel az ilyen üledék legalább tízszer több vizet tartalmaz, mint a benne levő csapadék nedves súlya volna centrifugálás után, az üledékhez vizet hozzáadni felesleges. Ezért a találmány szerinti eljárás e kiviteli módja esetében úgy járunk el, hogy az üledékhez a savas pH-érték megtartása mellett hozzákeverünk 1-—2 térfogatszázalék triklóretilént 20 térfogatszázalék alkoholban oldva, majd az üledék térfogatának 11%-át kitevő súlyú konyhasót adunk hozzá. Az elegyet alapos keverés után centrifugára visszük és a továbbiakban az előbb elmondottak szerint járunk el. Az elektrolit-koncentráció célszerű értéke 7% felett van, a felső határát az a koncentráció szabja meg, amely mellett a kivonatból az oldatban levő
