150556. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nyers heparin tisztítására
150.556 3 sót az alkohol még nem csapja ki a heparinnal együtt, mert ez esetben a tisztítást dialízissal kellene folytatni. Az alkalmazott só kationja ammo nium, vagy alkáli, anionja halogén, vagy nitrát, általában olyan legyen, hogy a só a heparin teljes kicsapásához szükséges 150—16’0% alkohol hozzáadása után se váljon ki, tehát ebből a szempontból célszerűtlen volna pl. alkáliszulfátok alkalmazása. Általában legcélszerűbb a konyhasó hasznáata. Igen lényeges szerepe van az extrakció közben adagolt zsíroldószernek, erre legalkalmasabb a kloroform, de az olcsóbb klórozott alifás szénhidrogének is jól használhatók, valamivel nagyobb mennyiségben alkalmazva. A szükséges mennyiség, ■— ami a jelenlevő lipoidok mennyiségétől is függ —, általában a teljes térfogatnak 0,5—2 térfogatszázaléka, ezt előnyösen ugyanabban a vízzel keveredő oldószerben oldva adjuk be, amit később használni fogunk a fehérjementes oldatból a tiszta heparin kicsapására, ez általában alkohol. Hogy a fehérjecsapadék nedvességtartalmában maradó heparmveszteség minél kisebb legyen, hígítás szempontjából előnyös az alkoholt minél nagyobb százalékban alkalmazni, — ennek határt szab az, hogy kb. 30% alkohol koncentráció mellett a heparin már rosszabbul oldódik. Tehát célszerű 20—25%-ot meg nem haladó mennyiséget alkalmazni. A találmány alkalmazásának előnyeit összehasonlító példán mutatjuk be, a legkorszerűbb ismert eljárást (a 2,797.184 számú amerikai szabadalom szerint) lefolytatott kísérlettel párhuzamosan. 1. példa: 15 liter nyers kivonathoz, amit az ismert Charles—Scott eljárással állítottunk elő, sósavat adunk pH-2 eléréséig, majd ülepedni hagyjuk. 24 óra után kapunk 1600 ml üledéket, amit alaposan felkeverve, hatóanyagtartalom meghatározására megmintázunk, majd kétfelé osztunk. A hatóanyagtartalma az USP. XIV. koagulációs módszer szerint vizsgálva 70,5/E/ml. Az első 800 millilitert a 2,797.184 USP szerint dolgozzuk fel úgy, hogy lúg hozzáadásával az elegy pH értékét 8,5-re állítjuk, majd beleoldunk 80 g. konyhasót. Utána savval pH 2,5-re savanyítjuk és poharas centrifugán 15 percig centrifugáljuk. Dekantálható 780 ml kissé zavaros szupematáns, ami miként 62,5 E heparint tartalmaz. (Ez 48,700 E jelent, ami a kiindulási 800 ml-ben mért 56.500 E-nek 86%-a.) Ezt az oldatot nátronlúggal pH 6-ra állítjuk, majd hozzáadunk 2 térfogat alkoholt, a képződött csapadékot centrifugával tömörít jük, abs. alkohollal mossuk és szárítjuk. Nyeredék 1,35 g szürkés színű por, ami vízben zavarosan oldódik és triklórecetsavval vizsgálva fehérje reakciót mutat. A hatóanyag tartalma 33,6 E/mg, azaz összesen 45,400 E, ami a kiindulási értéknek 81%-a. 2. példa: Az 1. példa szerinti üledék másik 800 ml részét a találmány szerint eljárva úgy dolgozzuk fel, hogy minden pH korrigálás nélkül hozzáadunk 160 ml alkohol és 8 ml kloroformból álló elegyet, majd 88 g konyhasót. 15 perc keverés után az 1. példához hasonlóan 15 percig centrifugáljuk, leönthető 860 ml kissé sárgás, de átlátszó szupernatáns, aminek a hatóértéke 61 E/ml, (ez összesen 52,500 E, azaz 93%-a a kiindulási értéknek). Az oldatot eredeti savas kémhatása mellett 1,3 térfogat — 1,1 liter alkohollal elegyítjük, a csapadékot centrifugálás és alkoholos mosás után megszárítjuk. Nyerünk 0,75 g szürkés port, ami vízben tisztán oldódik és triklórecetsavval nem ad fehérjereakciót. A por hatóanyag tartalma 66 E/mg, ami összesen 49,500 E, tehát 88%-os végső kitermelést értünk el. Az összehasonlításból látható, hogy a találmány szerinti eljárás egyszerűbb, a kapott termék lényegesen tisztább (66 E/mg, szemben a 33,5 E/mg-mal) és fehérjementes, azonkívül magasabb kitermeléssel is nyerhető. 3. példa: A RI—215. alapszámú magyar szabadalmi bejelentés szerint, 3600 kg marhatüdőből kinyert savas kémhatású (pH 2,2—2,8) heparin-fehérje csapadékot, melynek nedves súlya mintegy 80 kg, csapvízzel elkeverve 750 literre egészítünk ki és alapos homogenizálás után vizsgálatra mintát veszünk belőle. Azt találjuk, hogy a minta szárazanyagtartalma 18,3 mg/ml, és hatóanyagtartalma 63 E/ml, tehát nyerstermékünk ossz, hatóanyagtartalma 47,2 millió E heparin és fajlagos aktivitása 3,4 E/l mg szárazanyag. A 750 liter barna zavaros elegyhez 150 liter abs. alkoholba kevert 22 liter triklóretilént, majd 82,5 kg konyhasót adunk, % óráig kevertetjük, ezután másnapig magára hagyjuk. Másnap a fölöttes tiszta levet leszívatjuk, ez 600 liter tükrösen tiszta, sárgás színű oldat, — a csapadékot ülepítő centrifugán tovább tömörítjük. így nyerünk még toyábbi 200 liter oldatot, melyet az előzőhöz hozzáadunk. A 800 liter tiszta kivonat heparintartalma 48 E/ml, de a centrifugán visszamaradt mintegy 120 litert kitevő pépsűrűségű fehérje csapadékban még jelentékeny mennyiségű oldott heparin maradt. Ezt mosással nyerjük ki, úgy, hogy kétszeres mennyiségű, tehát 240 liter vizet adunk hozzá, majd belekeverjük az ennek 11%-át kitevő 26 kg konyhasót, végiül 50 liter alkoholban 7 liter triklóretilént. Fél órai keverés után ülepítő centrifugával le tudunk választani 310 liter enyhén opálos oldatot, aminek hatóanyagtartalma 15 E/ml. A kimosott fehérjeasapadékot elvetjük, a második kivonatot a 800 liter első kivonattal egyesítjük és keverés közben hozzáfolyatunk 1440 liter (130 tf%) abs. etanolt. Gyorsan ülepedő fehér csapadék válik le, pár óra múlva a tükrösen tiszta felülúszót dekantáljuk és alkohol regenerálásra adjuk, a kb. 150 liter üledékben maradt hatóanyagot centrifugán tömörítjük. A kapott csapadék nedvesen 4100 g súlyú, ezt abs. alkohollal kezelve és megszárítva 550 g terméket kapunk, aminek a hatóanyagtartalma 74 E/mg. A művelet folytán tehát a 3,4 E/mg fajlagos aktivitású nyerstermékből 74 E/mg fajlagos aktivitású terméket kaptunk és a kiindulási 47,2 millió E-ből 40,7 millió E-t, tehát 86,5%-ot nyertünk vissza ilyen tisztaságban.
