150177. lajstromszámú szabadalom • Eljárás coli-inaktív kobalamin-keverékek átalakítására coli-aktív származékokká

2 150.177 , Azt találtuk, hogy a Bj2-vitamki termelő fermentáció anyalúgjában maradó nyers íaktor-elegy — amely tehát főként coli-ínaktív faktorokat, mégpedig az inkomplett faktorok sorában kobirinsav- és kobinsav-származékokat, a komplett faktorok sorában pedig különféle dezamidált komplett kobalarnkiokat tartalmaz —, az egyes faktortípusok szétválasztása nélkül, egy műveletben alakítható át túlnyomórészt coli-inaktív inkomplett és komplett faktorokat (B faktor, fakor IIIA faktor, B12-vita>min) tartalmazó biológiailag nagy értékű termékké, ha ezt a fermentációs anyalúgot bepárolva vízmentes oldószerben célszerűen dimetilformamidban oldjuk, valamely pl. tercier amint, trietiiamint, továbbá klórszénsavetilésztert és l-amino-2-propanolt adunk hozza, majd ezt az elegyet kis idő múlva száraz ammónia-gázzal telítjük. Tercier aminként a találmány szerinti eljárásban trietilamiinon kívül pl. tributilamin, pirimidin sstb. is alkalmazható. A fenti eljárás során ugyanis az l-amino-2-propanol reagál a kobirinsav-származékokkal és ezeket a megfelelő kobmsav-származékofcká alakítja át; az eredetileg jelen volt ill. a fenti módon képződött kobinsav-származákok, valamint a karboxilos komplett faktorok, melyeknek klórszénsavetilészter hatására a vegyes anhidrid származékuk kialakult, ammónia hatására amidalódnak és így az összes inkomplett faktorból mikrobiológiai! ag aktív B faktor, a komplett faktorokból pedig, azok szerkezetétői függően B12-vita>mi)n, faktor TIT, A faktor és hasonló, fiziológiailag és mikrobiológiailag aktív származékok keletkeznek. A ko'balamin.-származékok kémiai viselkedésére vonatkozó jelenlegi ismereteink alapján egyáltalán nem volt előre látható, hogy ez az átalakítás, amely az ipari fermentációs melléktermékek feldolgozása terén egyáltalán, nem volt ismeretes, eredményesen végrehajtható lesz a különféle jellegű inkomplett és komplett faktorokat együttesen tartalmazó fermentációs melléktermékkel. A karbomsarvtartalmú faktorok ugyanis számos amimnal (pl. metilamin, monoetilamm, anílin) vegyes anhidriden keresztül reakcióba lépnek és anti-Bi2-vitamin hatású kristályos vagy amorf termékeket adinak. Az irodalom számos ilyen reakciót ismertet és így várható lenne, hogy ha a kobirinsav származékok -l-amino-2-propanollal történő átalakítását a karhoxilos faktorok jelenlétében, azok arnidálásával egyidejűleg végezzük, akkor ez utóbbiakból anti-B 12-vitamin hatású termékek jönnek létre. Meglepő módon azonban kitűnt, hogy ebben a reakeióelegybein a karfooxiles faktorok nem reagálnak az aiminoipropanollal, hanem csupán a kívánt amidálási reakció megy végbe és így kizárólag a fent említett kívánt, biológiailag értékes, coli-aktív termékek keletkeznek. A találmány szerinti eljárás részletes szemléltetésére az alábbi példák szolgálnak. 1. példa: A metanobaktériumos fermentáció üzemi feldolgozásából adódó karbonsaváé kobalamin frakciót, melyet fenol-kloroform vagy egyéb fenolszármazékkal végzett extrakció hídrokarbonátos lúgos vizes anyalúgjábói nyertünk, a szerves oldószer nyomaitól mentesítjük, 1'0%-os sósavval pH-ját 5—6-ra állítjuk. Ezután aktívszenet adunk addig hozzá, míg a leszűrt vizes oldat kis mintája színtelen nem lesz. A szenet elkülönítjük, majd deszt. vagy ionmentes vízzel addig mossuk, míg a leszűrt vizes oldat vezetőképessége a deszt. vagy ionmentesített víz vezetőképességét kb. 80%-ig meg nem közelíti. A szénről 5% benzoltartalmú 70%-os etainoliai ismert módon melegen leoldjuk az erősen színező anyagokat, majd 40 C°-ot meg nem haladó hőmérsékleten gyorsbepárlón bekoncentráljuk és tökéletesen leszárítjuk. Az így nyert sötétvörös színű anyagból 10 g-ot kimérünk. Kalorimetrikus módszerrel mérve dicián-fázisban 2,2 g színezéket (kobalamin keverék) kapunk, mely színezék milligrammja mellett 4,55 ing egyéb ballasztanyag is van. A 10 g-os kiindulási anyag 0,703 g E. coli-aktív anyagot tartalmaz. Ezután a 10 g el porított anyagot enyhe melegítés közben (40—80 C°) 100 ml vízmentes dimetil-íormaniidbaa oldjuk. Az oldatlan maradékot nem távolítjuk el. Az oldatot jeges vízben lehűtjük, majd a hűtést száraz jég-ace ton rendszerben tovább folytatjuk és a csapadékos oldatot —10CÜ és —30 C°" között tartjuk. A keverékhez 5 ml fémnátriummal abszolutizált és frissen desztillált trietilamint adunk, majd fél óra múlva 7 nil előzőleg ledesztillált klórszénsav etilészter és 7 ml dinietilformamid elegyét adjuk hozzá ügyelve arra, hogy az. említett alacsony hőmérsékletet állandóan fenntartsuk. Ujabb fél óra múlva 2,6 ml l-aniino-2-propa;nol és 2,6 ml dimetílformamid elegyét csepegtetjük iassan a keverékhez. A hűtést megszüntetve újabb 30 percig kevertet j ük az anyagot. A csapadékos elegybe ezután száraz ammóniagázt vezetünk. A gáz bevezetését úgy szabályozzuk, hogy kb. 6—8 perc múlva telítődjék az oldat. 30 perces várakozás után 250 ml benzolt öntünk a keverékhez. A kobalaminok az egyéb ballasztanyagokkal együtt csapadék alakban összetömörülnek; a szerves oldatot ezután a csapadékkal együtt szűrőpapírra öntjük. Az edényt és a leszívatott csapadékot több ízben aeetonnal átmossuk. A csapadékot ezután kevés deszt. vízben oldjuk, leszívatjuk, majd a szüredék pH-ját 10%-os sósavval 4-re állítjuk. A sötét vörösbarna színű, kb. 300 ml-nyi oldathoz 10 ml 10%-os NaCN oldatot adunk és pH-ját 10%-os sósavval 6-ra korrigáljuk. Fél óráig 56 C°-on tartjuk. Szobahőfokra való lehűtés után fenol-kloroform 1:1 (v/v) arányú elegyével a kobalaminofcat ismert módon kinyerjük, majd a vizes oldatot kloroformmal átmosva fenol nyomaitól mentesítjük. Kis részletét kromatográfiás papírra rászárítjuk. Jelző anyagokként izolált kobinamidot (B faktor), B12

-vitamint, B12-vitamin-faktor ÍÍI-at, A faktort.- B-vitamint alkalmazva, szék. butanolos oldószerelegyben szétválni hagyjuk a vizsgálandó keveréket. A külön-külön felvitt is-