150128. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vakcinák közbenső termékeinek előállítására

150.128 3 tenyésztése esetén olyan vizes közegeket nyerhetünk, amelyek a vírust ill. vírusokat tartalmazzák; ezeket a vizes közegeket pl. centrifugálás útján válatazthatjuk el a jelenlevő szilárd anyagoktól az inkubáció 2—14 napi, előnyösen 4—12 napi, legcélszerűbben pedig 8—9 napi folytatása után. Ha a találmány szerinti eljárással előáliíijtt terméket a közönséges nátha elleni vakcina készítésére kívánjuk felhasználni, akkor szükséges lehet a közegben jelenlevő antigén, pl. ultracentrifugálás, dialízis vagy ioncserélő oszlopon való átvezetés útján történő koncentrálása. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módját közelebbről az alábbi példák szemléltetik: 1. példa: Majomvese-szövet primer kultúrájából majomvese-sejtszuszpenziót készítünk. Ezt a sejtszusz• penziót oly mértékben hígítjuk, hogy ml-enként kb. 60 000 sejtet tartalmazzon, oly közegben, amely 5% borjú-szérumot és 0,5% laktalbumin-hidrolizáturaot tartalmaz Hank-féle sóoldatban, amelyhez 0,035% nátriumhidrogénkarbonátot, 100 E/ml penicillint és .100 mcg/ml sztreptomicint adtunk. E sztisízpenzióból 0,5 ml-nyi adagokat mértünk be kémcsövekbe és 3 napon át nyugalomban inkubáltattuk a sejteket. Ezután a közeget eltávolítottuk és 1.5 ml olyan új közeggel helyettesítettük, amely 2% borjú-szérumot, 0,25% laktalbuimint, valamint a fentebb megadottal egyező mennyiségű nátriumhidrogénkarbonátot és antibiotikumokat tartalmazott. Mindegyik kultúrához 0.2 ml mosófolyadékot mértünk be, amelyet náthás beteg vagy a nátha-vírus HGP törzsével fertőzött önkéntes kísérleti személy orrából nyertünk. A kultúrált forgódobba helyeztük, 33 C° hőmérsékleten, tartott inkubátorban. Kb. 5 nap múlva degeneráció jelei kezdtek mutatkozni a sejtrétegben; kb. 10 nap múlva a degeneráció már igen kifejezett volt és az ekkor elkülönített közeg nagy mennyiségű vírust tartalmazott. 2, példa: Az 1. példában leírthoz hasonló módon jártunk el, a pH-érték beállítására azonban oly nátriumfoszfát^tempítót alkalmaztunk, amely 0,05 mól végső koncentráció mellett 7,2 pH-értéket ad. ' Az alábbiakban azt ismertetjük példaképpen, hogy miként lehet a készítmény hatáserősségének meghatározására szolgáló vizsgálatot végrehajtani. A HGP-vírust tartalmazó készítmény hatáserősségét Rhesus majmok vese-sejtjeinek szekundér kultúráját tartalmazó szövet-kultúrán vizsgáljuk. Nyugvó kémcsövekben levő 0,5 ml oly közegbe, amely 0,5% laktaíbumin-hidrolizátumot tartalmazó Hank-féle sóoldatból és 5% borjú-szérumból áll és 0,03% nátriumhidrogénkarbonátoit, továbbá ml-enként 100 egység penicillint, 100 meg sztreptomicint és 20 egység mikosztatint tartalmaz, 30 000 .és 40 000 közötti számú sejtet altunk be. A kultúrát 24—48 óra hosszat 36 C° hőmérsékleten nyugalomban inkubaltatjuk, majd a közeget eltávolítjuk és 1,5 ml olyan új közeggel helyettesítjük, amely 2% borjú-szérumot és 0,25% lafctalbümin-hidrolizátumot tartalmaz, a fentebb említett előző közeggel azonos mennyiségű egyéb adalékok mellett. A kultúrákat ezután beoltjuk a vírust tartalmazó anyaggal; a beoltás vagy azonnal a közeg cseréje után történhet, vagy pedig pl. 1 nappal a közeg csere után; az így beoltott kultúrákat 33 C° hőmérsékleten inkubaltatjuk forgó dobban, az 1, példában leírttal megegyező körülmények között. A legjobb eredményeket az olyan közegekkel érhetjük el, amelyek közepes pH-órtéke 7,0 ós 7,4 között van. Az itt leírt eljárás egy módosított alakja esetében a kívánt pH-érték beállítása nátriumhidirogénkarbonát helyett olyan nátriumfcszfát-toimpító segítségével történhet, amely 0,05 mól végső koncentráció esetén 7,14 és 7,69 közötti pH-értéket ad a közegben. Az inkubáltiatás után a mintákat tartalmazó kémcsöveket mikroszkópos vizsgálatnak vetjük alá. a sejtrétegben előforduló ,.plaque"-ok megszámlálása céljából. E kísérleteik során azt fogjuk tapasztalni, hogy a beoltást követő kb. harmadik napig a vizsgálat alatt álló készítményben jelenlevő vírus koncentrációjával egyenes arányban áll a sejtrétegben előforduló ,,plaque"-ok száma. Ezek megszámlálása, sorén természetesen oly módon kell eljárni, hogy eleve meghatározzuk azt a minimális sejtszámot, ahány sejtnek egy ilyen góeszerű képződményben részt kell vennie ahhoz, hogy a szóban forgó képződmény ,;

plaque"-naik legyen tekinthető. így pl. megállapodhatunk abban, hogy egy ilyen gócnak legalább tíz sejtet kell tartalmaznia ahhoz, hogy az illető gócot ,,plaque"-nak tekintsük; ebben az esetben természetesen ugyanezt a megállapodást vesszük elapul az összehasonlító vírus-törzzsel végzett ellenőrző kísérlet eredményének kiértékelésékor. A megfigyelt eredmények kiértékeléseikor megállapodásszerűen figyelmen kívül hagyhatjuk azokat a mintákat, amelyekben szokatlanul nagyszámú, pl. 15—18 ,,plaque"-ot számláltunk meg. A ,,primér-plaque"-ok maximális kialakulása után kb. 3 nappal azt tapasztalhatjuk, hogy a „plaque"ok száma isimét emelkedni kezd; ekkor már feltételezhetjük, hogy ezek az utóbb képződött „plaque"-ok szekundér jellegűek és így nem veendők figyelembe a kísérletek kiértékelésekor. A fent leírt vizsgálati 'módszereknek majomvese-sejtkultúrákon HGP-vírusokikal végzett kísérletekben való alkalmazása során kitűnt, hogy a vírus szaporodásával alkalmas, itt leírt feltételek közül nern annyira a megfelelő pH-érték beállítására alkalmazott ion-fajtának van jelentősége, hanem maga a megfelelő pH-érték a fontos, így tehát a találmány szerinti eljárásban a hidrogénfcarbonát-ion alkalmazása nem tartozik a találmány lényeges jellemzői közé; ugyancsak nem lényeges jellemzője ez a fentebb leírt vizsgálati módszernek sem. A kívánt pH-érték beállítására alkalmas egyéb puffer-anyagok, mint pl. a fentebb említett foszfát-puff erek, ugyanilyen jól alkailmazhatók rnind a taüálimány szerinti eljárásiban, mind a fent leírt vizsgálati módszer gyakorlati kivitele során. Azt is 'tapasztaltuk, hogy ha a beoltásra alkalmazott HGP-vírust a kultúra közegébe való beoltás előtt egy nyúlon termelt specifikus hiper-