149062. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a szteroidok mikrobiológiai oxidációjára
2 149.062 ki: A tömény tenyészethez, amely hígítás után az oxidációt kivitelezni fogja, az adaptív enzimképződés megindítására annyi átalakító szteroidot adagoltunk, hogy a szteroid koncentrációja ne haladja meg a 400 mg/liter, előnyösen a 100—200 mg/litert.. Az organizmus a tenyésztési körülményektől függően fermentoríban' két óra, rázott lombikban négy órán belül szintetizálja a /fl-dehidrogenázt a szükséges mennyiségben. Az enzimszintézis megtörténtét úgy állapítottuk meg, hogy vizsgáltuk, mikor indul meg a beadagolt hidrokortizon átalakulása prednizolonná. Ezt, a már kialakult adaptív enzimrendszerrel rendelkező tenyészetet hígítottuk 25—30-szorosára olyan steril vízzel, amely 800—1000 mg/liter hidrokortizont tartalmazott és amelyből a szerves oldószert előzetesen kilevegőztettük. Ilyen körülmények között magas szteroidkoncentráció esetén is gyorsan és közel kvantitatív termeléssel megtörténik a biooxidáció. Találmányunk eljárás zll-es kettőskötést tartalmazó szteroidok előállítására /14,3-keto-csoportot tartalmazó szteroidokból, melyre jellemző, hogy az oxidáció elvégeztetéséhez előzetesen adaptáltatott és meghatározott — előnyösen 0,010—0,015 gramm% — szárazanyagtartalmú tenyészetet használunk és 0,5 g/liternél nagyobb, előnyösen mintegy 0,8—1,0 g/liter szteroidkoncentráció mellett végeztetjük el a biooxidációt. Eljárásunk kivitelezését a következő példák szemléltetik: 1. sz. táblázat Tenyészet kora órákban az 1. fermentor 2. fermentor adagolás után 0 0,040 0,045 2 0,240 0,300 4 0,510 0,576 6 0,585 0,885 8 0,780 0,990 10 0,945 1,230 12 0,915 14 0,840 16 0,825 Abban a - fermentorban, amelyből kiűztük az oxidáció megindítása előtt az acetont, gyorsabban és jobb termelést értünk el, mint a kontroll fermentorban. 2. példa: Az 1. példában megadott módon hígítottuk meg a C. simplex tenyészetünket, de mielőtt a hígító vízhez adtuk volna a szükséges mennyiségben a tömény tenyészetet, 0,4 és 8 órán át rázattuk 28°-os rázóasztalon 20 mg/100 ml hidrokortizon jelenlétében. Ilyen sorrendben adtuk aztán az 1., 2. és 3-as jelű fermentorhoz. A femmentorokhoz 2—2 g hidrokortizont adagoltunk és az eredményeket a 2. sz. táblázat mutatja be. 1. példa: C. simplex kétnapos burgonyás ferdeagar tenyészetéről 5 ml desztillált vízzel szuszpenziót készítettünk és ezzel oltottunk be 100 ml CSS jelű táptalajt (4,4 g KH2 P0 4 , 8,8 g Na 2 HP0 4 •7H2O, 20 g sörélesztőkivonat szárazanyag 1 literre feltöltve), 500 ml-es Erlenmeyer lombikban. Előzetesen a lombikokat 12 C°-on 25 percig sterilizáltuk. A beoltott lombikokat 28°-os termosztát szobában, 200-as fordulatszámú rázóasztalon inkubáltuk 24 óra hosszat. 3 db rázott tenyészettel oltottunk 5 liter táptalaj fermentorban és 24 órán át percenkénti 300-as fordulatszám mellett és percenként 5 liter levegőt átáramoltatva inkuháltuk a tenyészetet 28°-on. Közben 2 db 1. és 2. jelű fermeintorban 5—5 liter vizet sterilizáltattunk és ezekbe a hígító fermentorofcba 3—3 g hidrokortizont adtunk 200 ml acetonban feloldva. A 2. jelű hígító fermentorból 16 órán át tartó keveréssel és levegőztetéssel kihajtottuk az acetont. A 24 órás fermentoros tenyészetből 250—250 ml-t mértünk be sterilen a hígító fermentorokba és a térfogatot 5 literre egészítettük ki steril vízzel. Ez 20-szoros hígításnak felelt meg, az így hígított tenyészet denzitása a Biró—Fedorcsák-féle fotbkoloriméterben „9N" jelű szűrővel 'mérve, 0,240-es értéknek adódik. Ezután vette kezdetét az átalakítás. Az eredményeket az 1. sz. táblázat mutatja meg. A keletkezett prednizolon mennyiségét kén1 savas kromogénképzés alapján állapítottuk meg: 0,480-as extinkció felelt meg 20 mg/100 ml prednizolon tartalomnak. 2. sz. táblázat 0 u 0 0 -M -*-» Tenyészet kora 0) C 01 0) órákban az S s S adagolás után E-i "4H 4H -<N có 0 0,030 0,040 0,030 2 0,180 0,270 0,376 4 0,336 0,408 0,502 6 0,480 0,520 0,620 8 0,580 0,610 0,660 9 0,600 0,640 0,710 10 0,670 0,680 0,720 11 0,700 0,680 0,700 12 0,760 0,760 0,760 13 0,740 0,780 0,780 14 0,720 0,760 0,760 Adaptált tenyészetet adoglva tehát gyorsabban megindul az oxidáció. 3. példa: A 2. példában megadott módon készítettünk el 2 db fermentoros tenyészetet. Mindkét fermentorhoz 3—3 g hidrokortizont adagoltunk, és 16 órás levegőztetéssel kihajtottuk a fermentorból az acetont. Az első fermentorhoz nem adaptált, a második fermentorhoz 8 órán át adaptált tenyészetet tettünk. Az eredményeiket a 3. sz. táblázat foglalja össze.
