148444. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pszilocibin és pszilocin kinyerésére
148.444 3 ban beszárítjuk. A maradékot metanolban felvesszük és azt 10 g cellulózporral, hozzuk össze, mely porhoz 5% vizet adtunk. A metanolt vákuumban legőzöljük és a hatóanyaggal terhelt cellulózport 50 g cellulózporból álló oszlopra visszük fel, mely 5% vizet tartalmaz; az oszlopot előzőleg vízzel telített butanollal tisztára mossuk. Vízzel telített butanollal eluálunk és 10 ml-es frakciókat fogunk fel. Az egyes frakciókat nagyvákuumban legföljebb 50°-os fürdőhőmérsékleten pároljuk, majd vaskloridtartalmú jégecettel és tömény kénsavval hatóanyagtartalomra megvizsgáljuk. Ehhez 2 ml Keller-reagenssel olyan próbákat használunk, amelyek 0,25 mg maradékból állnak. A hatásos frakciókra ibolyaszínű (pszilo cibin) vagy tiszta kékszínű (pszilocin) Keller-reakció jellegzetes. Ezután egyesítjük azokat a frakciókat, amelyeknek azonos árnyalatú pozitív színreakcióik vannak. A fenti bepárlási maradékokból adódó amorf port 2 ml vízben oldjuk és az. oldatot 0,25 g ezüstkarbonáttal kirázzuk. Szűrés után a fölös mennyiségű ezüstiónokat kénhidrogénnel eltávolítjuk. A kíméletesen besűrített oldatból a pszilocibin színtelen finom tűk alakjában kristályosodik ki. 58 mg kristályos pszilocibint kapunk, ami a szárított terméstestekre számítva 0,24% hozamnak felel meg; a pszilocin nyomokban található. 2. példa: Pszilocibin és pszilocin kinyerése Psilocybe sempervia Heim et Cailleux színtenyészeteiből. a) Az oltóanyag előállítása: A Psilocybe semperviva Heim et Cailleux mexikói kalapgomba bazidiospóráiból színtenyészeteket sörcefre-agaron osztunk el. Erre a célra az érett terméstest lamelláiról leeső spórákat sterilen felfogjuk, sörcefre-agarra felvisszük és inkubáljuk. Az ily módon keletkező primerkultúrákból az oltóanyagot elegendő mennyiségben a következő módon állítjuk elő: A micéliumot steril vízvezetéki vízben durva lapáttal kaparjuk, úgyhogy finom micéliumpelyhek szuszpenziója keletkezik. Ezzel a szuszpenzióval Erlenmeyer-lombikok tartalmát oltjuk be. E lombikok tápoldatot és olyan nyereg alakú porcellántöltőtesteket tartalmaznak, mint amilyeneket desztillációs oszlopok töltésére használnak. A legjobb tapasztalatokat 300 ml erlenmeyerekkel szereztük, melyek (1 cm nagyságú és kb. 0,9 g súlyú) nyereg alakú, összesen 50 g súlyú töltőtesteket, valamint 80 ml tápoldatot tartalmaznak; ez utóbbi kb. 4%. szárazanyagtartalmú sörcefréből és 0,2% agárból áll. A kultúrát 24° hőmérsékleten inkubáljuk; két hét után a felületen kompakt micéliumtakaró képződött. Az egész kultúrát 30 perc hosszat forgó rázógépen rázzuk, miközben a nyereg alakú töltőtestek a micéliumot éles széleikkel apróra őrlik, amikor is finom szuszpenzió keletkezik micéliumpehelytartalommal. Az így nyert oltóanyag 50 liter tápoldat beoltásához elégséges. b) A kultúra előállítása: Friss, világos sörcefrét komlóadalék nélkül vízvezetéki vízzel annyira felhígítunk, hogy a szárazanyagtartalom 8%-ot tegyen ki. Az oldat minden literéhez a következő anyagokat adjuk: FeS04 -7H 2 0 0,00417 g ZnS04 -7H 2 0 0,00172 g Ca(N03 ) 2 1,0 g KH2 P0 4 0,0624 g MgS04 -7H 2 0 0,0624 g KCl 0,0312 g Agar-agar 2,0 g Ezt a tápoldatot egyliteres adagokban penicillinlombikokba töltjük és 25 perc hosszat autoklávokban 108°-on sterilizáljuk. Lehűlés után mindegyik lombikot a P. Semperviva Heim et Cailleux 2 ml szuszpenziójával beoltjuk. Az így kapott kultúrákat sötétben 24—26°-on inkubáljuk. A 2a.) alatt ismertetett micéliumtakaró képződik. c) A gombaanyag elkülönítése: Hét hét múlva az érett kultúrát gáz-szöveten keresztül szűrjük, a gombaanyagot kipréseljük és vákuumban 30°-on megszárítjuk. 100 penicillinlombikból álló tételből — mely összesen 100 liter tápoldatot tartalmaz — összegyűjtés után 49 nap elteltével 2450 g szárazanyagot nyerünk, vagyis a felhasznált tápoldat minden litere 25,4 g-t ad. A kultúraszűredéket, mely bizonyos mennyiségű hatóanyagot is tartalmaz, azonos eljárással dolgozzuk fel, mint amilyent a gombaanyag részére a következő fejezetben ismertetünk. d) A hatóanyagok kinyerése: 306 g szárított gombaanyagból finom port készítünk, majd háromszor külön-külön 500 ml kloroformmal és még háromszor ugyancsak különkülön, 10% etanolt tartalmazó 500 ml kloroformmal kirázzuk. Ekkor 2,8 g közömbös kísérőanyag oldatba megy. Az előextrahált gombaanyagot egyszer 3 liter és háromszor egyenként 1,5 liter metanollal teljesen kivonjuk. Az egyesített kivonatokat csökkentett nyomáson szárazra bepároljuk, amikor is 17,5 g világosbarna maradékot kapunk. Zsírszerű szennyeződések eltávolítására ezt a maradékot 17,5 ml vízben felvesszük és a szuszpenziót egyszer 500 ml és kétszer külön-külön 250 ml petroléterben kirázzuk. A petroléteroldat 0,75 g közömbös kísérőanyagot tartalmaz. A visszamaradó vizes oldatot vákuumban kb. 25 ml-re besűrítjük és erélyes kavarás közben lassan 250 ml absz. etanollal hozzuk össze. Az ekkor keletkező ragadós csapadékról a hatóanyagtartalmú oldatot dekantálással választjuk le. A csapadékot újból kevés vízben oldjuk és tízszeres mennyiségű absz. etanollal kezeljük. A maradék kicsapásos tisztítását még kétszer megismételjük. Az oldatokat egyesítjük és vákuumban szárazra bepároljuk. 11,7 g szilárd maradékot nyerünk, mely a hatóanyagok egész mennyiségét tartalmazza. A cellulózoszlopon végzendő kromatografáláshoz a maradékot lehetőleg kevés 50%-os metanolban oldjuk, az oldatot 40 g cellulózporral jól elkeverjük és az anyagot vákuumban megszárítjuk. Az ilyen módon szubsztanciával terhelt cellulózport olyan cellulózoszlopra visszük fel, amelyet
