147791. lajstromszámú szabadalom • Eljárás élesztő sejtfal-poliszacharid előállítására
2 147.791 elsősorban a heterogén rendszerben is igen aktív elasztázzal, igen rövid idő alatt eltávolítható. A találmány értelmében az élesztőt szerves oldószer jelenlétében autolízissel tárjuk fel, a vízoldható anyagokat vizes sóoldattal lúgos pH-értékek mellett kioldjuk, a visszamaradt vízoldhatatlan poliszacharidot ezután szerves oldószerrel kivonatolva tisztítjuk és az oldószert eltávolítjuk. Az autolízishez használhatunk kloroformot, etilacetátot, de a találmány értelmében igen előnyösen toluolt használunk. A szerves oldószerrel történő autolízist a sejtfal egyidejű mechanikus feltárása mellett végezzük. Így használhatunk késes homogenizátor berendezést, pl. Turmixot, Waring blendort stb. A vízoldható szennyezések eltávolítására célszerűen híg semleges só oldatát, > előnyösen 0,1 mólos NaCl oldatot használunk és az oldat pH-ját 8—9 értékre állítjuk be, pl. NaOH-val. A sóval való kivonatolást 40 C° alatt, előnyösen 25 C° alatt, szobahőmérsékleten végezzük. A vizes kivonatolás után visszamaradt sejtfalpoliszacharid kivonatolására szerves oldószerként igen előnyösen acetont használunk és e kivonatolást 10 C° alatt, előnyösen 0 C° alatt, pl. -—5 C°-on végezzük. A találmány szerinti eljárással kapott nyers vízoldhatatlan poliszacharidot enzimatikusan, előnyösen elasztázzal tisztítjuk, amikor is a még visszamaradt N-tartalmú szennyezéseket, főként a fehérjéket tudjuk eltávolítani. A N-tartalmú szennyezések eltávolítására alkalmazzuk még a fehérjék struktúrkötését lazító anyagokat (W. Kauzmann: Denaturation of proteins and enzymes; Mechanism of Enzyme Action 70 old. 1954), pl. guanidín, karbamid, formamid. Előnyösen azonban a tisztításhoz karbamidot használunk. A karbamid oldattal melegen, előnyösen 100 C°-on kezeljük a tisztítandó anyagot. A karbamidos kezelést pH 4 és pH 10 értékek között végezhetjük. Igen jó tisztító hatást állapítottunk meg pH 5 ill. pH 9 körüli értékeknél. Példák: 500 g pékélesztőt kútvízzel kimosunk. Centrifugálás után az üledékhez 34 ml toluolt adunk, késes homogenizátorral 1 percig kevertetjük és 37 C°-on autolizáljuk 8—12 órát. Az elfolyósodott élesztőt csapvízzel 3 l-re feltöltjük, 1 percig kevertetjük a késes homogenizátorral és centrifugáljuk. Az üledéket 500 ml desztillált vízben felvesszük, 18%-os NaCl oldatból annyit adunk hozzá (példánkban 32,5 ml-t), hogy 0,1 mólos legyen NaCl-re nézve és literre kiegészítjük desztillált vízzel, miközben a 10%-os NaOH-val az oldat vegyhatását pH 9-re állítjuk; késes homogenizátorral ezután megkever te tjük és centrifugáljuk. Az üledéket még kétszer extraháljuk 1—1 liter 0,1 mólos NaCl oldattal mint az előbb. Az üledéket négyszer mossuk 2—2 liter desztillált vízzel. Minden egyes alkalommal homogenizátorral felkeverjük és centrifugáljuk. Az üledéket —5C° hőmérsékletű absz. acetonnal kivonatoljuk, majd vákuum exszikkátorban szárítjuk. A kapott termék súlya: 30— Poliszacharid tartalom: 65%. C'3 inaktiváló képesség: 67%. •35 g. N-tartalom: 3,5%. (A készítmények komplementinaktiváló képességét Pillemer szerint 2 mg vizsgálandó poliszacharid és 1,5 ml sertés-szérum jelenlétében vizsgáltuk. (J. Exper. Med. 103 1. 1956). A továbbtisztítást az alábbi módokon végezhetjük: a) 30 g fentiek szerint . szárított port 2 liter 0,005 mólos Na2 HP0 4 pufferben (pH 7,8) felveszünk, hozzáadunk 5 ml desztillált vízben feloldott 150 mg elasztázt (10 E/mg hatóértékű). Termosztátban tartjuk 6 órát 37 C°-on, majd centrifugáljuk és az üledéket neutrálisra mossuk desztillált vízzel. —5 C° hőmérsékletű absz. acetonnal megszárítjuk és vákuum exszikkátorban tartjuk. A kész termék súlya: 19—20 £ Poliszacharid tartalom: 85%. C'3 inaktiváló képessége: 90%;. N-tartalom: 1,5% b) 30 g aceton-száraz port 2 liter 0,005 mólos Na2 HPC"4 pufferben (pH 7,8) szuszpendálunk, hozzáadunk 5 ml desztillált vízben feloldott 150 mg elasztázt. Termosztátban tartjuk 37 C°-on 24 óra hosszat, majd centrifugáljuk és az üledéket neutrálisra mossuk desztillált vízzel. Ezután -—5 C° hőmérsékletű absz. acetonnal megszárítjuk és vákuum exszikkátorban tartjuk. A termék súlya: 19—20 g. Poliszacharid tartalom: 82%. N-tartalom: 1,5%. C'3 inaktiváló képesség: 90%. c) 30 g acetonnal szárított port 1,5 liter 1 mólos karbamid oldatban felveszünk, a pH-ját 9-re állítjuk 10%-os imajd n NaOH-val és 1 órán át 100 C°-on tartjuk. Az üledéket centrifugálás segítségével neutrálisra mossuk desztillált vízzel, majd —5 C°-os absz. acetonnal megszárítjuk és vákuum exszikkátorban tartjuk. A termék .súlya: 25 g. Poliszacharid tartalom: 78%; . N-tartalom: 2,4%. C'3 inaktiváló képesség: 85%. d) 30 g aceton-szárított port 1,5 liter 1 mólos karbamid oldatban veszünk fel, a pH-ját n HCl-el 5-re állítjuk és 1 óra hosszat 100 C°-on tartjuk. Az üledéket centrifugálással semleges pH-ig mossuk desztillált vízzel, majd —5 Cc -os absz. acetonnal szárítjuk és vákuum exszikkátorban tartjuk. A termék súlya: 24—25 g. A készítmény poliszacharid tartalma: 75%. C'3 inaktiváló képesség: 78%. N-tartalma: 2,7%.
