144524. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hasnyálmirigyből előállított elasztolitikus enzimkészítmény egyes enzimkomponenseinek szétválasztására

2 144.524 kis mennyiségben kollagénmukoproteinázt és elasztázt tartalmazó középfrakciót különítünk el, majd az oldószer töménységének további növelésével az elasztázt ejtjük ki és a folyadéktól elkülönítjük. A mukolitikus enzim elkülönítése után a fentemlített középfrakciót előnyösen 40 és 60 térfogat % közötti etil-, vagy metilalkohol, illetve 25 és 40 térfogat % közötti aceton koncentráció határértékeknél nyerhetjük. A találmány értelmében elasztolitikus enzimkészítmény egyes enzimkoponenseinek szétválasztását megvalósíthatjuk továbbá úgy is, hogy az enzimkészítmény gyengén savanyú vegyhatású, szerves oldószert tartalmazó híg vizes oldatából a mukolitikus enzimet a szerves oldószer koncentrációjának növelésével kicsapjuk és elkülönítjük, ezután a szerves oldószert az oldatból pl. desztillálással eltávolítjuk, a vizes enzimoldatból az elasztázt adszorbensen megkötjük, majd sót tartalmazó, vizzel elegyedő szerves oldószerrel leoldjuk, az oldatból a szerves oldószer töménységének fokozásával kicsapjuk, végül elkülönítjük a folyadéktól. Az enzimek szétválasztására kiindulási anyagként az elasztolitikus enzimkészítmény 1—8, előnyösen 2—4%-os vizes oldatát használjuk. A vizes oldat hidrogénion-koncentrációját pH 7,0-nél alacsonyabb, egészen pH 4,0 értékig terjedően választjuk meg. Igen előnyösen találtuk, ha mintegy 5,0 pH-érték mellett dolgozunk. ' A találmány értelmében az 'elasztolitikus enzimkészítmény vizes oldatából a mukolitikus enzimet 15 és 25 térfogat % közötti metilalkohol, vagy etilalkohol, illetve 15 és 20 térfogat % közötti acetonkoncentráció jelnlétében csapjuk ki. A proteolitikus enzimet, az elasztázt pedig 60 és 85 térfogat %, előnyöesn mintegy 78 térfogat % metilalkohol vagy etilalkohol, illetve 35 és 55 térfogat % közötti acetonkoncentráció értékek mellett választjuk le. Az elasztolitikus hatású enzimoldat frakcionálását célszerűen hűtött oldatban, előnyösen — 2 és — 8 C° között végezzük. 1. -példa 8 g adszorpciós úton előállított elasztolitikus enzimkészítményt üvegpohárban, vagy Erlenmeyer lonbikban szobahőmérsékleten 400 ml 50 pH 4,8 acetátpufferben oldunk. A víztiszta oldathoz 15 C°-on 100—104 ml abszolút etilalkoholt adunk vékony sugárban, állandó keverés közben, ezáltal az oldat alkobolkoncentirációját 20—22 térfogat %ra állítjuk be. Az edényt ekkor 6—8 C° hőmérsékletű hűtőtérben lassan hagyjuk lehűlni és másnapig itt tároljuk. A 16—24 órai állás közben gyengén megzavarasosodótt oldatot ezután — 2 —5 C° hőmérsékletre hűtjük és 24—48 órán át ezen a hőmérsékleten tartjuk. Az oldat zavarossága közben fokozatosan nő s a kristályos állapotban kiváló mukolitikus enzim, a kollagénmukoproteináz, az edény aljára kiülepszik. A frakcionálási művelet kezdetétől számított 72—96 óra elteltével az enzimet centrifugálással elkülönítjük, 20%-os vizes etilalkohollal mossuk, majd abszolút etilalkohollal, acetonnal szárítjuk. Kitermelés 1,6—2,0 g. A mukolitikus enzim elkülönítésekor kapott fölötteslevet — 5C°-ra hűtjük s hozzá vékony sugárban, állandó keverés köziben vele egyenlő térfogatú abszolút etilalkoholt adunk, Az 58—62 térfogat % etilalkohol koncentráció határok közt nyert csapadékot —• ez a középfrakció hatástalan fehérjéken kívül kismennyiségű mukolitikus és proteolitikus enzimet egyaránt tartalmaz — centrifugálással különítjük el, majd a fölöttes léhez —4 —8 C° hőmérsékleti határok között vele egyenlő térfogatú abszolút etilalkoholt adunk. Az 58—.82 térfogat % etilalkohol koncentráció határok között kicsapódó proteolitikus enzimet, amely az elektroforésto vizsgálatok szerint —• a kollagénmukoproteinázhoz hasonlóan — homogén fehérjelként viselkedik, centrifugálással elkülönítjük, 80 térfogat %-os vizes etilalkohollal mossuk, végül abszolút oldószerekkel szárítjuk. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy a víz-alkoholos mosá s után az enzimet deszt, , vízben, vagy híg pufferoldatban oldjuk s fagyasztott állopotból szárítjuk. Kitermelés 3—4 g. 2. példa 3 g Hall eljárása szerint nyert elasztolitikus enzimkészítményt szobahőmérsékleten néhány ml 60 térfogat %-os vizes metilalkohollal megnedvesítünk, majd az oldószer 50—100 ml-ével dörzscsészében eldörzsölünk. Ezután az anyagot üvegpohárbavagy Erlenmeyer lombikba visszük át, térfogatát 60 térfogat %-os vizes metilalkohollal 300 mire egészítjük ki, s 30—60 percen át szobahőmérsékleten elektromosan kevertetjük. Keverés után fokozatosan — 5 C°-rahűtjük s ezen a hőmérsékleten ismét 1 órán át kevertetjük. Keverés után az oldatlan maradékot hidegszobában vagy hűtött centrifugában történő cenrifugálással elkülönítjük, a fölöttes léhez pedig vele egyenlő térfogatú hideg abszolút metilalkoholt adunk vékony sugárban, állandó keverés közben. A képződő csapadékot, a proteolitikus hatású elasztázt, 80 térfogat %-os vizes metilalkohollal mossuk, majd abszolút oldószerekkel, vagy —• vizes oldatából —• fagyasztott állapotból szárítjuk. A 60 térfogat %-os vizes metilalk oh ólból hidegen kiülepített enzimkeverék-írakcióból a mukolitikus enzimet úgy különítjük el, hogy a nedves csapadékot szobahőmérsékleten 100 ml 20 térfogat %-os vizes metilalkoholban oldjuk; az oldatot fokozatosan 5—8 C°-ra, majd erről a hőmérsékletről —2 — 6 C°-ra hűtjük. A vizes alkoholos oldat pH-ját előzetesen pl. acetátpufferrel 4,80^ra állítjuk be. A 72 órán belül kristályosan kiváló kollagénmukoproteinázt az oldattól centrifugállással elkülönítjük, 20%-s vizes metilalkohollal mossuk, majd abszolút oldószerekkel, illetve sósvízes oldatából fagyasztott állapotból szárítjuk. 3. példa Banga eljárása szerint kapott elasztolitikus enT zimkészítmény 6 g-nyi mennyiségét szobahőmérsékleten 170 ml M/50 pH 5,0 acetátpufferben oldjuk, a víztiszta oldathoz vékony sugárban, állandó keverés közben 30 ml vízmentes acetont adunk. Ezáltal az oldat acetonkoneentrációját 15 térfogat %-ra állítjuk be. Az enzimoldatot ezután fokozatosan —'3 —'6 C°-ra hűtjük le és ezen a hőmérsékleten tartjuk 3—4 napon át. Az alacsony hőmérsékleten néhány óra elteltével megzavarosodó oldatban a mukolitikus enzim kiválása maximumát 72—96 óra múlva éri el. Ekkor az enzimet az ol-