144524. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hasnyálmirigyből előállított elasztolitikus enzimkészítmény egyes enzimkomponenseinek szétválasztására

Megjelent: 1959. augusztus 15. ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS 144.524. SZÁM 6. a. 14—23. OSZTÁLY — GO-553. ALAPSZÁM Eljárás hasnyálmirigyből előállított elasztolitikus enzimkészítmény egyes enzimkomponenseinek szétválasztására Gyógyszeripari Kutatóintézet, Budapest Feltalálók: dr. Bagdy Dániel, dr. B. Banga Ilona, dr. Baló József és dr. Hegyeli Endre A bejelentés napja: 1956. szeptember 21. Az emlős hasnyálmirigyeik a két évtized óta általánosan ismert fehérje- (tripszin, kimotripszin, karboxipeptidáze stib.), szénhidrát- (amiláz, mialtáz stb.) és zsírbontó (lipáz) enzimeken (1), valamint hormonokon (insulin, kalliikrein) (2) kívül más, biológiai szempontból fontos hatóanyagokat is tartalmaznak. Ezek közül Baló és Banga (3) nevéhez fűződik a rugalmas rostok fehérjét, az elasztiht bontó enzimnek a felfedezése. Ez az enzim, az elasztáz, a felfedezők megfigyelése szerint kapcsolatba hozható az egyik legjobban elterjedt népbetegség, az arteriosclerosis (érelmeszesedés) kifejlődésével (4). Míg ifjú és felnőtt korban egészséges egyének hasnyálmirigyének elasztoliitikus enaiimtartalma jól meghatározott határértékek között mozog, addig az érelmeszesedésben szenvedő egyének hasnyálmirigyében az enzkntairtalom igen alacsony, átlagos mennyisége nem haladja meg a normál átlag 5—6%-iát. Baló és Banga felfedezése, valamint ez utóbbi tény számos kutató figylmét fordította a kötőszövet biokémiájának tanulmányozása, a kötőszövetre ható szerves katalizátorok előállítása és tulajdonságaik megismerése felé. Bangának (5) 1952—ben a klasszikus kisózési módszer alkalmazásával sikerült izolálnia és kristályos formában előállítani egy igen hatásos enzimkészítményt. Angolszász kutatók, Hall és munkatársai (6) frakcionált dialízissel és acetones kiicsapással igyekeztek továbbfejleszteni Banga módszerét. A szakirodalomban leint eddigi eljárások azonban nem vezettek sem kémialilag, sem biológiailag egységes végtermékhez. Az elasztáz hatásmechanizmusával kapcsolatos kutatások is egyértelműen arra mutattak, hogy a homogénnek feltételezett hatóanyag legalább két különböző hatású enzim keveréke (6), amelyek közül az egyik fehérjebontó (proteolitikus), a másik pedig aminocükrot tartalmazó összetett szénhidrátot bontó (mukolitikus). Az elasztolitikus enzimek szétválasztására az irodalom még nem ismertetett megfelelő eljárást. Egyedül Hall közöl adatokat a két enzim elkülönítésére vonatkozólag, megemlítvén, hogy a szétválasztás kalciunifoszfátgéles, valamint alumíniumoxidos adszorpció útján vihető keresztül (7). A módszer részletei, hatásossága és hatásfoka azonban máig sem került közlésre. Saját (kutatásaink során azt találtuk, hogy egyrészt az irodalomból ismert eljárásokkal, másrészt az általunk kidolgozott adszorpciós módszerrel (8) előállított elasztolitikus hatású enzimkészítmények mukolitikus és preteolitikus komponense jól elválaszthatók egymástól, ha az emzimpreparatum megfelelő hidrogénionikoncentráoióra és ionerősségre beállított, alacsony hőmérsékletre hűtött vizes oldatához vizzel jól keveredő szerves oldószert adunk és .a szerves oldószer koncentrációját 15—85 térfogat % közöt fokozatosan növeljük. Találmányunk lényege az a felismerés, hogy az előzőekben jellemzett feltételek között az elasztolitikus enimzkészítmények egyes összetevőinek oldékonysága a szerves oldószer koncentrációjától függően lényegesen eltér egymástól. Míg a mukolitikus enzimek —> a legújabb vizsgálatok ugyanis arra mutatnak hogy a mukolitikus komponens maga sem egységes — az oldatból a szerves oldószer alacsony koncentrációjának jelenlétében kiválnak és elkülöníthetők, addig a proteolitikus enzim ilyen körülmények között oldatban marad, s oldatából a szerves oldószer lényegesen magasabb koncentráció-értékénél csapható ki. A találmány értelmében a hasnyálmirigyből előállított elasztolitikus hatású enzimkészítmény egyes enzimkomponenseit oly módon választjuk szét, hogy az enzimkészítményt vízzel elegyedő szerves oldószer híg vizes, savanyú vegyhatású oldatával oldjuk, majd az így kapott oldatban a szerves oldószer koncentrációjának növelésével a muikolitikus enzimet, a kollagenmukoproteinázt kicsapjuk és elkülönítjük, ezután az oldószer töménységének növelésével az elasztázt csapjuk ki, és különítjük el. Az enzimek elkülönítésénél célszerűen úgy járunk el, hogy a mukolitikus enzim kicsapása után a szerves oldószer töménységét növeljük, de csak oly mértékben, melynél az elasztáz főtömege még nem csapódik ki és ily módon inert fehérjéket és