Varga Máté - Szentpéteri József (szerk.): Két világ határán. Természet- és társadalomtudományi tanulmányok a 70 éves Költő László tiszteletére - A kaposvári Rippl-Rónai Múzeum közleményei 6. (Kaposvár, 2018)
Csapó János: Új módszer a fosszilis csontok korának meghatározására az aminosavak racemiációja alapján
ÚJ MÓDSZER A FOSSZILIS CSONTOK KORÁNAK MEGHATÁROZÁSÁRA AZ AMINOSAVAK RACEMIZÁCIÓJA ALAPJÁN 35 Az utóbbi időben többen kísérleteztek a mikrohullámú technológia alkalmazásával a fehérje hidrolízise során,54 és többen beszámoltak a rövid ideig magas hőmérsékleten végzett hidrolízissel kapott kiváló eredményekről is.55 Úgy tűnik, hogy a mikrohullámmal végzett hidrolízis folyamán jelentős racemizáció lép fel, hisz a mikrohullámú kezelést aminosav racemizáció kiváltására is használták.56 Nem okoz gondot a racemizáció akkor, ha nem kívánjuk az aminosav enantiomereket meghatározni, hanem megelégszünk az összes aminosav tartalom meghatározásával. Amennyiben célunk az aminosav enantiomerek szétválasztása és meghatározása, olyan fehérjehidrolízis módszert kell választani, melynek során minimális a racemizáció, hisz a hidrolízis alatt fellépő számottevő racemizáció esetén nem tudjuk eldönteni, hogy az aminosav enantiomerek egy része eredetileg is benne volt a mintában, vagy csak a hidrolízis folyamán keletkezett. Több módszert dolgoztak ki a fehérjehidrolízis során bekövetkező racemizáció visszaszorítására,57 azonban ezek hosszadalmasak, illetve nehézkesek voltak. Fentiek miatt egy magas hőmérsékleten és rövid ideig végzett fehérje hidrolízis módszert dolgoztunk ki a lehető legkisebb racemizáció elérésére a hidrolízis folyamán. Hibaforrást jelenthet a savas hidrolízisnél még az, hogy az aszparagin és glutamin a hidrolízis folyamán aszparaginsavvá és glutaminsavvá alakul át. Nem alakult ki egységes vélemény azt illetően, hogy vajon a fossziliák tartalmazzák-e a két savamidot, mennyi ezek dezaminációs ideje és vajon milyen hibát okozhatnak ezek a vegyületek a kormeghatározásban. Bada meghatározta58 néhány aminosav racemizációs, illetve az izoleucin epimerizációs felezési idejét 7.6 pH értéknél 0 és 25 °C-on. Az általa vizsgált aminosavak közül a leggyorsabb racemizációs idejű fenilalanin felezési ideje 25 °C-on 2000 év, 0 °C-on 160.000 év. Ugyanezek az értékek az aszparaginsavnál 3.500 és 430.000 évnek, az alaninnál 12.000 és 1.400.000 évnek, az izoleucinnál pedig 48.000 és 6.000.000 évnek adódtak. Kísérleti eredményei bizonyították azt a peptidkémikusok által már régóta ismert tényt, hogy legkönnyebben azok az aminosavak racemizálódnak, amelyek aromás oldalláncot (tirozin, fenilalanin) vagy indol- és imidazolcsoportot (triptofán, hisztidin) tartalmaznak, és legnehezebb racemizációra bírni az apoláros oldalláncot tartalmazó valint, izoleucint és leucint. Bada és Protsch az aszparaginsav hidrolízis alatti racemizációját vizsgálva összefüggést állapított meg59 a hidrolízis közbeni racemizáció és a becsült kor között. Vizsgálataik eredményeit a 4. táblázat tartalmazza. A táblázat adataiból látható, hogy egy százalékos racemizáció a hidrolízis folyamán az aszparaginsav esetében 700 évvel hamisítja meg a kormeghatározást. A hidrolíziskor keletkezett D-Asp mennyisége (%) 0 1 2 3 4 5 6,5 Számított idő (1.000 év)22,4 21,7 21 20,3 19,6 18,8 17,7 4. táblázat. A fehérjehidrolízis során lejátszódó racemizáció hatása a fosszilis csontok korára (Bada - Protsch 1973. nyomán) Neuberger az aminosavak bázis katalizálta racemizációjára az alábbi mechanizmust írta le.60 Első lépésként az a helyzetű protont egy bázis elvonja és a tetraéderes konfigurációból egy planáris szerkezetű anion jön létre, mely a továbbiak során egy proton fölvételével stabilizálódik. Neuberger szerint bármilyen helyettesítés a karboxil csoporton fokozza a racemizációt, mivel ez megkönnyíti az а-helyzetű proton leszakadását és hasonló hatás érhető el akkor is, ha a ß-helyzetü szénatomhoz egy elektronegatív szubsztituenst kapcsolunk. Manning bizonyította az а-helyzetű proton elvonást és rekombinálódást, mint a racemizáció első lépését az а-helyzetbe beépült tricium mérésével.61 További vizsgálatok során a fentiekben leírt neubergeri megállapítások megerősítést nyertek, és Smith és munkatársai egyértelműen leszögezték,62 hogy a relatív racemizációs arányt egy fehérjében több tényező (sztérikus, szomszéd, oldószerhatás) együttes hatását figyelembe véve lehet csak becsülni. 54 Chen et al. 1987; Woodward - Gilman - Engelhart 1990; Gilman - Woodward 1990; Pickering - Newton 1992. 55 Chiou - Wang 1988; Csapó et al. 1994. 56 Chen - Wu - Wang 1989. 57 D'aniello - Giuditta 1980; Smith - Khatib - Sudhakar Reddy 1983; Reddy et al. 1989. 58 Bada 1971 59 Bada - Protsch 1973. 60 Neuberger 1948. 61 Manning 1970. 62 Smith et al. 1976.
