Varga Máté - Szentpéteri József (szerk.): Két világ határán. Természet- és társadalomtudományi tanulmányok a 70 éves Költő László tiszteletére - A kaposvári Rippl-Rónai Múzeum közleményei 6. (Kaposvár, 2018)
Csapó János: Új módszer a fosszilis csontok korának meghatározására az aminosavak racemiációja alapján
36 CSAPÓ JÁNOS Neuberger egy másik elképzelése, miszerint a peptidkötésben lévő aminosavak racemizációja lényegesen gyorsabb mind a sav, mind a bázis katalizálta reakciókban, mint a szabad aminosavakban ugyancsak bizonyítást nyert a későbbiek folyamán. Fentiekből az a következtetés adódik, hogy a dipeptidben lévő aminosavak gyorsabban racemizálódnak, mint a szabad aminosavak, és a növekvő racemizációs sebesség a peptidlánc hosszának növekedésével még tovább növekszik. Ebből adódóan feltétlenül kell ismerni a szabad és a kötött állapotban lévő aminosavak racemizációs folyamatait. Fentieknek homlokegyenest ellentmond az a megfigyelés, hogy a kövületekben és üledékekben a szabad aminosavak jobban racemizálódnak mint a fehérjében kötött aminosavak.63 Ezt Hare azzal magyarázta,64 hogy a fehérjelánc szétszakadásakor az aktivált állapotban lévő aminosavak nagyobb hajlandóságot mutatnak a racemizációra mint a kötöttek. Bada és Schroeder szerint65 viszont sokkal valószínűbb az a mechanizmus, hogy a fehérjéből származó szabad aminosavak racemizációját a nyomnyi mennyiségben jelenlévő nehézfém-ionok katalizálják, tehát nyilvánvaló, hogy az aminosavak fossziliákban történő racemizációja egy igen bonyolult és összetett folyamat, melyet befolyásol a hidrolízis és a katalitikus hatás is.66 Fentiekből az is következik, hogy a szabad aminosavak, a peptidek és a fehérjék más és más arányú racemizáción mennek keresztül, és a három frakció közül a fehérjék a legstabilabbak a racemizáció tekintetében, hiszen kevésbé hajlamosak a fémek általi katalízisre. A szabad aminosavak racemizációját elsősorban a pH67 és a fémionok (Ca2+, Mg2+) befolyásolják. Smith és munkatársai bizonyították,68 hogy az ionerősség is jelentős tényező, hiszen növekvő ionerősség hatására növekszik a racemizáció is. Értékelve az elmondottakat leszögezhető, hogy más a racemizáció a szabad, a peptidben lévő, avagy a fehérjében kötött aminosavaknál, és e három frakciónál a racemizációt a különböző környezeti hatások másként befolyásolják. Úgy tűnik, hogy a fehérjében kötött aminosavak racemizációjára van a legkisebb hatással a pH és az ionerősség, tehát a három frakció közül ez a legmegbízhatóbb a kormeghatározás tekintetében. Az a tény viszont, hogy lúgos körülmények között a racemizációs folyamatok felgyorsulnak, felhívja a figyelmet arra, hogy a fehérje kinyerés folyamatából a lúgos extrakciót lehetőleg el kell hagyni. Az elmondottaknak nem mond ellent az sem, hogy a szabad aminosav, illetőleg peptidfrakció is értékes információt szolgáltathat a régész számára. Anyag és módszer Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfía a D- és L-aminosavak szétválasztására és meghatározására Az aminosav enantiomerek szétválasztása és meghatározása az l-(9-fluorenil) etil kloroformáttal történő származékképzés után fordított fázisú folyadékkromatográfiával A készülék. Az alkalmazott Varian 5500 LC gradiens képzésre alkalmas rendszerrel, Varian 9090 mintaadagolóval és gázműködtetésű, 10 pl-es hurokkal ellátott Valco injektorral rendelkezett. Shimadzu RF-535 fluoreszcenciás detektort használtunk a származékok mennyiségének mérésére; a gerjesztési és az emissziós hullámhossz 260 és 315 nm volt. Az elválasztás folyamatának és az automatikus mintaadagoló munkájának ellenőrzésére, a mintafelvitelre és a kromatogramok tárolására a Varian DS 651 vezénylő rendszert használtuk. Az automatikus mintaadagolóhoz szükséges ampullákat a Varian cégtől (Solna, Sweden) szereztük be. Vegyszerek. A FLEC reagenst az EKA-Nobel (Surte, Sweden), az aminosav standardot a Sigma (St. Louis, МО), a bórsavat és az OPA reagenst a Merck (Darmstadt, D), a jódecetsav nátriumsóját és a jódazidot pedig a Fluca (Buchs, D) cégtől vásároltuk. Az acetonitrilt, a tetrahidrofuránt, az acetont, a pentánt és az etilacetátot (mind HPLC minőségű) a Rathburn cégtől (Walkerburn, UK) kaptuk. Származékképzés. Az a-aminosavak és az iminosavak származékképzése. A reakciót és az extrakciós lépéseket 190 pl-es mikrofiolában végeztük, melyet egy teflon membránnal ellátott csavaros tetejű üvegcsébe helyeztünk. Az automatikus mintaadagolót úgy programoztuk, hogy keverjen össze 25 pl pufferben (0.2M borát puffer, pH=9.0) oldott mintát 25 pl FLEC reagenssel (5nM acetonban) a mikrofiolában. Ezt követően a reakcióelegyet 80 pl nitrogén átbuborékoltatásával jól összekevertük, majd 10 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk. A reakció lejátszódása után 60 pl extrakciós elegyet adtunk hozzá (pentán:etilacetát, 85:15), és nitrogén átbuborékoltatásával hatszor összekevertük. Ezt követően 10 percig állni hagytuk, majd az alsó fázisból tápláltunk be az enantiomerek analízisére. Minden mintabetáplálást megelőzően és követően a rendszert aceton:víz 85:15 arányú elegyével hatszor átmostuk. 63 Dungworth et al. 1973; Bada 1975. 64 Hare 1971. 65 Bada - Schroeder 1972. 66 Bada 1975. 67 Bada 1972. 68 Smith ETAL. 1976.
