Varga Máté - Szentpéteri József (szerk.): Két világ határán. Természet- és társadalomtudományi tanulmányok a 70 éves Költő László tiszteletére - A kaposvári Rippl-Rónai Múzeum közleményei 6. (Kaposvár, 2018)
Csapó János: Új módszer a fosszilis csontok korának meghatározására az aminosavak racemiációja alapján
ÚJ MÓDSZER A FOSSZILIS CSONTOK KORÁNAK MEGHATÁROZÁSÁRA AZ AMINOSAVAK RACEMIZÁCIÓJA ALAPJÁN 33 vakból az 5-dimetil-aminonaftalin-1-szulfonil fluoreszkáló származékot képezték és fordított fázisú folyadékkromatográfiával az N,N'-di-n-propil-L-alanin (L-DPA) és réz acetát királis töltet alkalmazásával az összes fehérjealkotó aminosav D- és L-enantiomerjét szét tudták választani egy mintából.36 Véleményük szerint a módszer mennyiségi meghatározásra kiváló, érzékeny, gyors, a módszer továbbfejlesztése során az aminosav analízishez hasonló módszerré alakulhat. Marfey ugyancsak nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszert fejlesztett ki az enantiomerek szétválasztására.37 Az 1-fluor-2,4-dinitrofenil-5-L-alanin-amid segítségével - mely egy igen reakcióképes fluor atomot tartalmaz - diasztereomer származékokat hozott létre D- és L-aminosavak keverékéből. Ezeket a származékokat nagynyomású folyadékkromatográfiával trietil-aminfoszfát és acetonitril eluensek megfelelő gradiensét alkalmazva igen jó eredménnyel szét tudta választani és mennyiségileg meghatározni. Közleményében a D- és L-aszparaginsav, glutaminsav, metionin, alanin és fenilalanin elegyének szétválasztását közli, de a feltételek megfelelő változtatásával lehetőség van a többi aminosav enantiomer szétválasztására is. Biológiailag aktív anyagok optikai tisztaságának ellenőrzésére Knabe,38 Gübitz és Mihellyes,39 Gübitz és munkatársai40 egy direkt módszert dolgoztak ki nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiával. A módszer lényege a királis oszlop, mely kémiailag kötött L-hidroxiprolin-Cu2+ komplexből áll. A mozgó fázis Cu2+ tartalmú vizes oldat. A fenti stacionáris fázis alkalmazásával mód nyílik mindazon vegyületek optikai tisztaságának ellenőrzésére, melyek kelát komplexeket képeznek a Cu2+ ionokkal, amilyenek például az aminosavak. A módszer hibája az előzőekben említettekhez képest az, hogy egyszerre csak egy aminosav D- és L-alakját lehet vele meghatározni. Az aminosav enantiomerek mennyiségi meghatározásához nem elég csak az enantiomereket egymástól elválasztani, de ügyelni kell arra is, hogy az enantiomerek a többi aminosavtól vagy azok származékaitól is jól elkülönüljenek. Ezen túl, a megfelelő érzékenység elérésére kis mennyiségben is jól detektálható aminosav származékot kell képezni. Az utóbbi időben erre a célra széles körűen alkalmazták a fluoreszcens reagensekkel történő oszlop előtti származékképzést és a származékok fordított fázisú kromatográfiáját (RPC). E módszereknél a kimutathatóság határa a meghatározni kívánt aminosavaknál igen kicsi, és az analitikai rendszer flexibilitása is rendkívüli előnyöket rejt magában.41 így többek között automatikus módszereket fejlesztettek ki az optikailag inaktív o-ftálaldehid/merkaptoetanollal (OPA) az a-aminosavak,42 a 9-flurenilmetil kloroformáttal (FMOC-CI) pedig az a-aminosavak és az iminosavak együttes meghatározására.43 A királis reagenssel történő származékképzés után lehetőség van a fehérjeépítő aminosavak enantiomerjeinek szétválasztására és meghatározására egyetlen analízis során RCP-vel. Mivel a kromatográfiás elválasztás általában 50-70 percet is igénybe vesz, nagyon fontos, hogy a kidolgozott analitikai módszer teljesen automatikus legyen. Előfeltétel még az egyszerű származékképzési reakció, mely szobahőmérsékleten rövid idő alatt végbemegy. Az optikailag aktiv tiolok és az OPA valamint a meghatározni kívánt aminosavak közti reakciót felhasználták aminosav enantiomerek szétválasztására és meghatározására.44 A királis 1-(9-fluorenil)etil kloroformát (FLEC) használata az enantiomerek szétválasztására azzal az előnnyel is jár, hogy az nemcsak az a-aminosavakkal, de az iminosavakkal is stabil származékot képez.45 Külön említést érdemel a geokronológiában való igen gyakori alkalmazása miatt a D-allo-izoleucin analitikája. A hidroxiprolin és a treonin mellett az izoleucin az, amely két aszimmetria centrummal rendelkezik. Az izoleucinból az idők folyamán keletkező D-allo-izoleucin - mely az izoleucin diasztereomerje - a rutinszerűen alkalmazott ioncserés aminosav elválasztás során az izoleucin és a metionin között jelenik meg a kromatogrammon, azoktól jól elváló, jól értékelhető csúcsot ad. Az а-helyzetű szénatom racemizációját, a D-allo-izoleucin képződését a peptidszintézis folyamán igen behatóan tanulmányozta Bodanszky és Conklin.46 Vizsgálták többek között a sósavas hidrolízis és a különböző harmadrendű aminok hatását a racemizációra. Nagyon fontos annak ismerete is, hogy a fehérje hidrolízise során történik-e racemizáció, hisz - amennyiben igen - az a mérési eredményeket meghamisíthatja. Különböző tanulmányok beszámoltak arról, hogy a racemizáció foka a hidrolízis folyamán függ a peptid, illetve a fehérje típusától, az aminosav környezetében levő többi aminosavtól, és megállapították, hogy a peptidkötésben lévő aminosavak általában gyorsabban 36 Weinstein - Weiner 1984. 37 Marfey 1984. 38 Knabe 1984. 39 Gübitz - Mihellyes 1984. 40 Gübitz - Juffmann - Jellenz 1982 41 Lindroth - Mopper 1979; Tapuhi et al.1 981; Einarsson et al. 1987. 42 Smith - Pacino 1985. 43 Cunico et al. 1986; Betner - Földi 1988. 44 Aswad 1984; Buck - Krummen 1987. 45 Einarsson - Josefsson - Lagerkvist 1983; Einarsson - Folestad - Josefsson 1987; Einarsson 1985. 46 Bodanszky - Conklin 1967.
