Hadak Útján. A népvándorlás kor fiatal kutatóinak konferenciája (Szeged, 2000)
Csapó János - Csapó-Kiss Zsuzsanna - Csapó János jun.: Mira használható az aminosavanalitika a régészetben?
CSAPÓ János - CSAPÓ-KISS Zsuzsanna - CSAPÓ János jun. ÖSSZEFOGLALÁS A fehérjék aminosavtartalma (D-aminosav is) meghatározásának legfontosabb lépése a fehérjék hidrolízise. A meghatározás során minden olyan lépést kerülni kell, ahol jelentős mértékű racemizáció léphet fel, mert az a D-aminosavak mennyiségét meghamisítaná. Ezért a hagyományos módszerekhez képest egy új, rövid ideig magas hőmérsékleten végzett hidrolízismódszert dolgoztunk ki egyrészt a racemizáció lehető legkisebb szintre szorítása, másrészt az oxidációra érzékeny amino- savak pontos meghatározása érdekében. A módszer lényege a 170 °C-on 30 percig 6M sósavval végzett hidrolízis, mely a fehérjét minimális racemizációval hidrolizálja aminosavakra. Ezt követően két módszert hasonlítottunk össze az -aminosav enantiomerek szétválasztására és meghatározására. Az első módszer szerint o-ftálal- dehiddel (OPA) és az optikailag aktív 2,3,4,6-tet- ra-O-acetil-l-tio-ß-glükopiranoziddal történő származékképzés után fordított fázisú folyadékkroma- tográfiával határoztuk meg a D-aminosavakat. A származékképzés során a reakció szobahőmérsékleten néhány perc alatt lejátszódik, és a kapott származékok igen stabilak. A képzett diasztereomerek szelektivitása — a lizin és az ornitin kivételével — különösen jónak mondható. A származékok fluo- reszcenciás gerjesztési és emissziós maximuma 342 és 410 nm volt. A kimutathatóság határa fluoreszcens detektor esetén 2 pmol, elektrokémiai detektor esetén pedig 1 pmol volt az aminosavak többségére. Ezután kipróbáltuk az -aminosav enantiomerek szétválasztására és meghatározására, valamint az iminosavak szelektív meghatározására az l-(9-fluor- enil)etil kloroformáttal történő származékképzés után kapott származékokat fordított fázisú kroma- tográfiával. Rendkívüli előnye az alkalmazott eljárásnak az, hogy a reagens mindkét enantiomer- jének (+FLEC és -FLEC) használatával megnő a csúcsok azonosításának megbízhatósága, mivel a reagens másik enantiomerjével végezve el a származékképzést, megváltozik a diasztereomer származékok eluciós sorrendje. A D- és az L-hid- roxiprolin cisz- és transz módosulatát a módszerrel tökéletesen el lehet választani egymástól. Mindkét módszer segítségével meghatároztuk a szabad aminosavak valamint a fehérjék racemi- zációját a folyadék- és gázfázisú hidrolízis során, valamint elvégeztük néhány ismert korú csontminta D- és L-aminosavtartalmának meghatározását. Miután kidolgoztuk az igen alacsony szintű ra- cemizációt okozó fehérjehidrolízis-módszerünket, hazánk különböző laboratóriumaiból összegyűjtöttünk mintegy 100 db fosszilis csontmintát, melyek korát korábban a Debreceni ATOMKI-ban radiokarbon módszerrel meghatározták. Meghatároztuk ezen minták D- és L-aminosavtartalmát származékképzés után fordított fázisú folyadékkromatog- ráfíával. Ezt követően a D- és L-aminosav mennyiségéből meghatároztuk a D/L-arányokat, melyeket ábrázolva az idő függvényében ún. kalibrációs görbéket szerkesztettünk. Ezután a kalibrációs görbéket használtuk ismeretlen csontminta korának meghatározására, miután meghatároztuk annak D- és L-aminosavtartalmát. Mivel az aminosavak race- mizációját nemcsak az élő szervezet halála után eltelt idő, hanem a talaj hőmérséklete, pH-ja, nyom- elemtartalma és egyéb más körülmények is befolyásolják, a radiokarbon keltezésre, mint abszolút módszerre történő kalibrálással a környezet okozta racemizációs hibákat ki tudtuk küszöbölni. A D- és az L-aminosavak analízise után kitűnt, hogy a kormeghatározásra leginkább az alábbi aminosavak alkalmasak, mert egyrészt nagyobb mennyiségben fordulnak elő még a 100 000 évnél idősebb csontokban is, másrészt pedig viszonylag könnyű őket HPLC-vel meghatározni: hisztidin, fenilalanin, aszparaginsav, glutaminsav, alanin, izo- leucin és valin. Vizsgálataink során meghatároztuk ezen aminosavak racemizációs felezési idejét, és ettől függően a kormeghatározás szempontjából az aminosavakat különböző csoportokba tudtuk osztani. A hisztidin a fenilalanin és az aszparaginsav alkalmas az ún. fiatalabb minták korának becslésére (2-35 000 év), a glutaminsav és az alanin a 10-80 000 év közötti mintákra, míg az izoleucinnal és a valinnal a 30 000-450 000 év közötti minták kora becsülhető. Elemeztük a kidolgozott módszer pontosságát is. Megállapítottuk, hogy 6-10 000 év közötti mintáknál egy aminosav használata esetén a módszer pontossága ±500-600 év, több aminosav használata esetén pedig ±200-300 év. Kutatómunkánk során rájöttünk arra, hogy a csont nagyon kevés kéntartalmú metionint és cisz- tint tartalmaz, ezért ezek oxidált származékai a csontok esetében korbecslésre nem használhatók, illetve használatuk a korbecslést vagy -meghatározást nagyon bizonytalanná teszi. Ezzel szemben a gyapjú, a haj, a köröm, a pata stb. csonthoz viszo454
