Hidrológiai Közlöny, 2017 (97. évfolyam)
2017 / Különszám - SZAKCIKKEK - Lippai Anett, Káli Szandra, Vájná Balázs, Szuróczki Sára, Tóth Erika: A Dandár fürdő mikrobiológiai vizsgálata
10 Hidrológiai Közlöny 2017.97. évf. különszám a megnövelt inkubációs idő (Davis és társai 2004) és speciális tenyésztéses technikák (pl. poliuretán blokkok) használata ( Yasumoto-Hirose és társai 2006). A tenyésztéses eljárások hátrányai miatt célszerű a vízminták összes sejtszámát is meghatározni, illetve molekuláris vizsgálatok segítségével diverzitás vizsgálatokat végezni. CÉLKITŰZÉS Munkánk célja a Dandár fürdő 44°C-os forrásvizének (DF), egy beltéri töltő-ürítő típusú 38°C-os medencéjének (DM1), egy beltéri töltő-ürítő típusú 20°C-os medencéjének (DM2) és egy kültéri vízforgatásos 38°C-os (DM3) medencéjének mikrobiológiai vizsgálata. ANYAG ÉS MÓDSZER Mintavétel Az első mintavétel 2015. március 04-én történt a Dandár fürdő forrásvizéből (DF1) és három medencéjéből (DM11, DM21, DM31). A forrásvíz a fürdő ivókútjá- ból származott, hőmérséklete 44°C-os, pFl-ja 7,5. A DM1 medence 26,5 nm2-es, 38°C-os, pH-ja 7,2; a mintavételkor 12 fürdőző tartózkodott a medencében. A DM2 merülő medence 13,5nm2-es, 20°C-os, pH-ja 7,1; a mintavételkor 1 fürdőző tartózkodott a medencében. A DM3 medence kültéri, 38°C-os élmény medence, pH-ja7,2; a mintavételkor 8 fő tartózkodott a medencében. A molekuláris vizsgálatokhoz sor került egy második mintavételre is 2016. február 17-én (DF2, DM12, DM2 2, DM3 2), ekkor a medencékben tartózkodó emberek számáról nem kaptunk információt. A mintavétel mindkét esetben 1 L-es, steril csavarku- pakos üvegekbe történt a mikrobiológia szabályainak figyelembe vételével az MSZ EN ISO 19458:2007 szabványnak megfelelően, mind a folyamatos áramlású ivókút- ból, a medencékből merítéses technika által (a vízfelszín alól 10-15 cm-ről). Mintafeldolgozás tenyésztéses vizsgálatok céljából A tenyésztéses vizsgálatokhoz tápanyagban szegény 10%-os R2A táptalajt (Reasoner és társai 1985) és a Gel- lért fürdő korábbi vizsgálata során alkalmazott minimál médiumot (Szuróczki és társai 2016) használtunk, agar- agar és gelrite szilárdító ágensekkel, desztillált víz helyett fürdővízzel elkészítve. A vízmintákból steril desztillált vízzel hígítási sorozatot készítettünk, majd minden hígítási tagból a négyféle táptalajra szélesztettünk. A forrásvíz esetében az inkubáció 44°C-on 9 napig tartott, a DM1 és DM3 medencék esetében 38°C-on 7 napig, a DM2 medence esetében 20°C- on, szintén 7 napig. A közvetlen szélesztés mellett a forrásvízből purhab tömbös dúsítást is végeztünk {Szuróczki és társai 2016), a dúsítókat 3 héten át 44°C-on termosztáltuk, majd hígítási sorozatot készítve a közvetlen szélesztéshez hasonlóan négyféle táptalajra szélesztettünk. Minden technika esetén a kinövekvő kolóniákból 50-50-t random módon izoláltunk, majd a tenyészeteket tisztítottuk. A tenyésztett törzsek DNS-ét izoláltuk {Szuróczki és társai 2016), polimeráz láncreakciót követően {Kalwasinska és társai 2015), ARDRA módszerrel csoportokat képeztünk. A csoportreprezentásokat és a csoporton kívül eső törzseket 16S rRNS génjük bázissorrend elemzése alapján azonosítottuk {Szuróczki és társai 2016). Mintafeldolgozás összes sejtszám meghatározásához A vízminták összes sejtszámát DAPI festést követően határoztuk meg epifluoreszcens mikroszkóp alkalmazásával {Máthé és társai 2014). A medencék vizéből 1-10-50 ml-eket, a forrásvízből 100-200-300 ml-eket szűrtünk steril polikarbonát szűrőn. Mintafeldolgozás T-RFLP vizsgálathoz Munkák során T-RFLP (terminális restrikciós fragmenthossz polimorfizmus) módszerrel is vizsgáltuk a minták bakteriális diverzitását. A forrásvízből 500 ml-t, míg a medence vizekből 200 ml-t szűrtünk 0,45 pm pórusátmérőjű cellulóz-észter (Whatman ME 25/21 STL) filteren keresztül. A közösségi DNS kivonását az UltraClean Soil DNS Isolation Kit (MoBio Laboratories Inc., USA) protokollja alapján végeztük, a gyártó utasításainak megfelelően. Az amplifikációhoz fluoreszcensen (HEX) jelölt 27 forward (5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) és 534 reverz (5’-ATT ACC GGG GCT GCT-3’) primere- ket használtunk. A PCR reakció és a kapott termékek enzimatikus emésztését {Szuróczki és társai 2016) követően nagy felbontású kapilláris gélelektroforézis segítségével végeztük el a DNS fragmentumok elválasztását, ahol a fluoreszcensen jelölt szakaszokat a műszer lézerfény segítségével detektálta {Sipos és társai 2007). A T-RFLP során kapott kromatogramokat a GeneMapper® Software v3.7 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) segítségével elemeztük ki. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK Összes sejtszám meghatározásának eredményei A vízminták összes sejtszámának értékeiben legalább egy nagyságrendnyi különbség figyelhető meg a forrásvíz és a medencék között. A forrásvízben (DF1) 1,43*104 sejt/ml; a DM1_1 medencében 4,94*106 sejt/ml; a DM21 medencében 2,6*106 sejt/ml; a DM31 medencében 7,83 *105 sejt/ml értékeket kaptuk. A medencékből származó vízminták sejtszámának magasabb értékei egyrészt az antropogén hatással, másrészt a különböző érintettségü környezettel (beltéri és kültéri medencék, vízkezelés módja) magyarázhatók. Emellett a zárt térben és a külső környezetben a levegő hőmérséklete, páratartalma, stb. is eltérő, továbbá a kültéri medencékbe jelentős mennyiségű egyéb környezeti mikroorganizmus kerülhet a vizekbe. Az azonos hőmérsékletű medencék közül a beltéri 38°C-os medence (DM1_1) sejtszáma bizonyult a legmagasabbnak, itt a víztisztítás töltő-ürítő rendszerrel történik. A töltő-ürítő rendszereknél a vízforgatásos kezeléssel ellentétben nem alkalmaznak fertőtlenítőszereket, a medencék vizét minden nap ürítik, majd friss forrásvízzel töltik fel. Tenyésztéses vizsgálatok eredményei és értékelésük Munkánk során összesen 222 törzs tiszta tenyészetét hoztuk létre: 61 törzset a forrásból (5 faj), 55 törzset a DM1 medencéből (5 faj), 52 törzset a DM2 medencéből (16 faj), 54 törzset a DM3 medencéből (9 faj). A 16SrRNS
