Hidrológiai Közlöny, 2014 (94. évfolyam)
2014 / 1. szám - Eck-Varanka Bettina - Horváth Eszter - Andreidesz Kitti - Kováts Nóra: Kagyló mikronukleusz teszt és bakteriális tesztek érzékenységének összehasonlítása kommunális szennyvíz genotoxikus hatásának becslésére
66 ni. Az első megközelítésre példa Kolarevic és mtsai (2009) tanulmánya: ebben terepen gyűjtött amuri kagyló (Sinanodonta woodiana) egyedek felhasználásával a Duna szerbiai szakaszának környezeti állapotát értékelték. A teszttel sikerült szennyező-források (pl. kommunális szennyvíz kibocsátás, mezőgazdaság, olajfinomító) o- kozta környezetterhelés hatását kimutatni. Woznicki és mtsai (2004) laboratóriumi kísérletben a benzo[a]pirén genotoxikus karakterét mutatták ki, szintén amuri kagyló felhasználásával. Tudomásunk szerint eddig még nem végeztek olyan összehasonlító munkát, amelyben kommunális szennyvízre ill. általában genotoxikus komponensekre párhuzamosan vizsgálták volna kagyló mikronukleusz teszt ill. bakteriális genotoxicitás tesztek érzékenységét. Jelen munkának éppen ez a célja: a kagyló mikronukleusz tesztet vetjük össze az SOS Chromotest és Ames teszt érzékenységével, ill. a mikronukleusz tesztet egyéb szempontok (ráfordítás, precizitás) alapján is értékeljük. Anyag és módszer Mintavétel és mintaelö'készités A felhasznált szennyvíz Veszprém város előülepített nyers szennyvize, ami a BAKONYKARSZT Víz- és Csatornamű Zrt.-től származik. A mintavétel 2013. július 1-jén történt, a mikronukleusz tesztet közvetlenül a Oszennyvíz beérkezése után indítottuk, a bakteriális tesztek elvégzéséig a mintát mélyhűtőben (-18°C) tároltuk. Tesztszervezetek gyűjtése, akklimatizálás A vizsgálatokhoz felhasznált festőkagyló (Unió picto- rum) egyedeket a Balatonból gyűjtöttük (Gyenesdiás strand), egy motorcsónakról vontatott mintavevő eszköz segítségével. Az egyedeket 1 hónapig a laboratóriumban akklimatizáltuk (t=18-24°C, oldott oxigén=85-93 %, pH =7,98-8,72). Az akklimatizáció során átfolyó vizes akváriumban tartottuk őket, amely vízutánpótlását közvetlenül a Balatonból kapta, így a kagylók táplálását is biztosítottuk. Mikronukleusz teszt A szennyvizet 10-, 20-, 30- illetve 40-szeres hígításban vizsgáltuk. A kontroll ebben az esetben 3 liter bala- tonvíz volt. Az expozíciós idő 4 nap volt (Woznicki és mtsai 2004). A méréseket szemisztatikus jelleggel végeztük, azaz a mintaoldatot a 4 napos expozíciós idő a- latt, tekintettel arra, hogy a szennyvízben előfordulhatnak olyan szerves komponensek, amelyek bomlása a ge- notoxikusság változását okozhatja, 2 nap elteltével cseréltük. A teszt elvégzéséhez 3 1 térfogatú akváriumokat használtunk. A vizsgálatok megkezdése előtt a kiválasztott példányokat lemértük és egyedileg jelöltük. Minden e- gyes akváriumban 5-5 egyedet helyeztünk el, az U. pic- torum egyedek hossza 5-8 cm közé esett, míg a súlyuk átlagosan 20-40 gramm volt. Az akváriumokat folyamatosan levegőztettük, vízhőmérséklet 20-22°C volt. Az expozíciós idő letelte után az egyedekből a Gustafson és mtsai (2005) által leírt nem-letális technikával hemolim- fa mintát vettünk. A begyűjtött hemolimfához 7:3 arányban 10 %-os ecetsavas metanol fixatívát adtunk, majd 5 percig 1000 rpm sebességgel centrifugáltuk. A felülúszó eltávolítása után a sejteket 1 ml 80%-os metanolban fel- szuszpendáljuk, így a további felhasználásig néhány hétig hűtőben eltartható. A festés napján a fixált mintákat 1000 rpm fordulatszámon 5 percig centrifugáltuk, majd lepipettáztuk a felülúszó nagy részét, hogy a folyadék koncentráltabban tartalmazza a hemolimfa sejteket. Ebből az elegyből mikroszkóplemezre cseppentettünk kb. 0,3 ml-t és szabad levegőn beszárítottuk. Ezután 80 %-os metanollal borítottuk, száradás után 5%-os Giemsa oldattal festettük 20 percig. A mintákat ezután desztillált vízzel óvatosan leöblítettük, a mosófolyadék színtelene- déséig, majd még nedvesen fedtük. A mintát egy számítógéppel összekötött mikroszkóp (Zeiss AxioCam ICC 1-es kamerával felszerelt Axio-Sco- pe A1 mikroszkóp) alá tettük, és a Zen 2011 program segítségével minden mintából 250 sejtet leszámoltunk. A mikronukleuszos sejtek azonosítását a Fenech és Neville (1992) által leírt szempontok szerint végeztük. Antes teszt A kísérleteket Hubbard és mtsai (1984) protokolljának alapján, kisebb módosításokkal végeztük el. A módszer leírása röviden: a Salmonella typhimurium TA100- as törzs sejtjeit 10* 105 db/ml végső koncentrációban vettük fel 10 ml, megfelelő hígításban szennyvizet tartalmazó Davis minimál tápoldatban (67,4 mM P043', 8,38 mM S042', 15,1 mM NH4+, 5,1 mM Na+, 98,1 mM K+, 0,83 mM Mg2+, 1,7 mM citrát, 139 pM glükóz, 10 pg/ml hisztidin, 0,1 mg/ml D-biotin, 100 pg/ml ampicillin). Majd az oldat 96 lyukú mikropléten, 32 ismétlésben 200 pl-es térfogattal került szétosztásra. Sejt- és kezelőszer mentes kontroll, valamint 5 mg/ml-es koncentrációjú nátrium-aziddal pozitív kontroll is beállításra került. A pléteket nedves kamrában, 37°C-on 72 óráig inkubáltuk. A leolvasás napján a mintákhoz 20 pl, 2 mg/ml-es koncentrációjú brómkrezolbíbor vizes oldatát adtuk. A lila szín megjelenése negatív, a sárga szín pozitív eredményt (sejtnövekedést) jelez. Átmeneti szín megjelenése esetén a lyukat automatikusan pozitívnak tekintettük. A kísérletet S9 aktivációval kiegészítve (a máj metabolikus aktivitását modellezendő) is elvégeztük, amelynek során a 10 ml sejtszuszpenzió 2,5 ml S9 keveréket is tartalmazott, a gyártó utasításainak megfelelően összeállítva. Pozitív kontrollként ekkor 2-amino-antracént alkalmaztunk 100 pg/ml-es koncentrációban. A teszt kiértékelése %2 próbával történt (Hubbard és mtsai 1984). SOS Chromotest A tesztet az SOS-ChromoTest TM kit (EBPI) segítségével végeztük el a gyártó utasításai szerint, az OECD (471:1977) szabványban rögzítetteknek megfelelően. A minták abszorbancia értékeinek leolvasása 615 és 405 nm-es hullámhosszokon történt. A minták genotoxicitásának meghatározásához a genotoxikus anyag SOS rendszerre gyakorolt aktiváló hatásának kifejezésére alkalmas indukciós faktort (IF) számítottuk ki Krifaton (2012) munkájában leírtaknak megfelelően, amelynek 1,5 feletti értéke esetén a minta az a- dott hígításban genotoxikusnak tekinthető. Eredmények és értékelés A festőkagyló egyedek szennyvizes kezelést követő mikronukleusz számai az 1. ábrán láthatóak az egyes hígítások esetében. A mikronukleusz szám alakulása egyértelmű koncentrációfüggő hatást mutat. HIDROLÓGIAl KÖZLÖNY 2014. 94. ÉVF. 1. SZ.
