Hidrológiai Közlöny, 2014 (94. évfolyam)
2014 / 4. szám - Tóth Szilvia - Surányi Gyula: Cianotoxin-cianofág-gazdasejt kölcsönhatások vizsgálatai laboratóriumi modellrendszerben
32 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2014. 94. ÉVF. 4. SZ. percet igényel, majd a fágciklus programjának végrehajtása következik, amelyben a gazdasejt fehérjeszintézise létrehozza a fágfertőzéshez kapcsolódó proteineket és az ún. fágfehérjéket. A fehérjeszintézis vizsgálatok első lépéseként 60 perces pulzusjelöléseket végeztünk kétszeres fágmultiplici- tással fertőzött gazdasejt tenyészetekből vett mintákban, amelyek között, az ún. fágkontrollok mellett, a fágfertő- zésen túl 25 pg/ml mikrocisztinnel is kezelt minták is voltak. A két ún. fágkontroll fertőzési ideje és a kettős kezelésű minták (fágfertőzés-mikrocisztin) kezelési időpontjai között 60 perces időeltolást (adszorpció) alkalmaztunk; kísérleti eredményeinket 3 db ún. fertőzési marker protein (fág- ill. fágfertőzéshez kapcsolódó fehérje) különböző kísérleti körülmények között mért jelölési intenzitása (szintézis) alapján fogalmaztuk meg (3. ábra). Az ún. fertőzési marker proteinek molekulatömege a következő volt; 66, 28 és 18 kDa. A proteinszintézisben a késleltetés minden kettős kezelési kombináció esetében kimutatható (3. ábra). A fehérjemintázat továbbá egyértelműen bizonyítja, hogy a fágfertőzésnek és a toxinkezelésnek a 2x fágmultiplicitásnál nincs kumulatív hatása, vagyis nincs kettős hatás. A fehérjeszintézis vizsgálatok második lépéseként 30 perces pulzusjelöléseket végeztünk egyszeres fágmultipl- icitással fertőzött gazdasejt tenyészetekből vett mintákban. A fágkontrollok mellett, a fágfertőzésen túl 25 pg/ ml mikrocisztinnel is kezelt minták is voltak. A két ún. fágkontroll fertőzési ideje és a kettős kezelésű minták (fágfertőzés-mikrocisztin) kezelési időpontjai között 30 perces időeltolást (adszorpció) alkalmaztunk (4. ábra). A 240-300. perces mintavételi időpontoknál a fágkon- trollt és a késleltetett fágkontrollt összehasonlítva a fertőzési marker proteinek aktuális mennyisége a 0 perces fágkontroll mintában nagyobb (4. ábra). A két fágkontroll egymáshoz való viszonyát összehasonlítási standard- nek használva, az egyidőben illetve a mikrocisztin kezelést követően alkalmazott fágfertőzés is csökkent, részben gátolt fágfehérje- vagy fágfertőzéshez kapcsolódó fehérje mintázatot eredményezett (4. ábra). A fágkontrollok és a kettős kezelések esetében kapott különbségek a fágciklus végére (360’) kiegyenlítődnek. Mennyire tekinthetjük célzottnak azt a hatást, amelyet a mikrocisztin az AS-1 cianofággal fertőzött Synecho- coccus sp. PCC6301 tenyészetekben a fehérjeszintézisre, a fág- és fágfertőzéshez kapcsolt proteinek szintézisére gyakorol? A kérdés eldönthető, ha az ismert prokarióta fehérjeszintézis inhibitor, a kloramfenikol gátló- és a mikrocisztin korábban bemutatott, fehérjeszintézist módosító hatását összevetjük modellrendszerünkben (5. ábra). A kloramfenikol 0.8-3.2 pg/ml koncentrációban részlegesen, de a koncentráció növelésével arányosan gátolja az összes gazdafehérje szintézisét, 6.4 pg/ml koncentrációtól kezdve ez a proteinszintézis gátlás teljessé válik (5. ábra). A Synechococcus sp. gazdasejt proteinszintézisét részben gátló 0.8 és 1.6 pg/'ml koncentrációjú kloramfenikol az AS-1 fággal fertőzött gazdasejt tenyészeteket (lx multiplicitás) is gátolja, de ez nem célzottan érinti a fág- és fágfertőzéhez kapcsolt fehérjék szintézisét, vagyis a mikrocisztin és a kloramfenikol fágciklusra gyakorolt hatása eltér (5. ábra). Összefoglalás A felszíni vízterekben a cianotoxin produkciót biztosító cianobaktérium tömegtermelés megszűnésében potenciálisan szerepet játszó cianofág-gazdasejt-cianotoxin interakció vizsgálatára laboratóriumi körülmények között alkalmas modell- és kísérleti módszert alakítottunk ki. ,Az AS-1 cianofágra, annak Synechococcus sp. PCC- 6301 nevű gazdasejtjére és ezek mikrocisztin-LR kezelésére épülő modellrendszerben radioaktív prekurzorokkal végzett fehérjeszintézis vizsgálatok révén kimutattuk a mikrocisztin-LR célzott, a fág- és fágfertőzéshez kapcsolható fehérjék szintézisének kinetikáját módosító hatását. A kloramfenikollal kezelt fágfertőzött Synechococcus sp. tenyészetek fehérjemintázatát összevetve a mikrocisztinnel kezeitekével megállapítható, hogy a két vegyüld alapvetően eltérő specifítással és medianizmu§ szerint hathat a fág- és fágfertőzéshez kapcsolt fehérjék szintézisére. Irodalom 1. Carmichael, W.W., M.F. Watanabe, K.-I. Harada, W.W. Carmichael, and H. Fujiki (ed.),. 1996. Toxic Microcystis and the environment, p. 1-11.In Toxic Microcystis. CRC Press, Boca Raton, FL. 2. Gademann, K., and Portmann, C. Secondary Metabolites from Cyanobacteria: Complex Structures and Powerful Bioactivities. 2008 Current Organic Chemistry' 12:326-341. 3. Laemmli 1970 Nature 227, p. 680-685. 4 Mitsuhiro Yoshida, Takashi Yoshida, Aki Kashima, Yukari Taka- shima, Naohiko Hosoda, Keizo Nagasaki, and Shingo Hiroishi. 2008. Ecological Dynamics of the Toxic Bloom-Forming Cyanobacterium Microcystis aeruginosa and Its Cyanophages in Freshwater. Applied and Environmental Microbiology, May 2008, p. 3269- 3273. 5. Mühling, M., N. J. Fuller, A Millard, P. J. Somerfield, D Marie, W. H. Wilson, D. J. Scanlan, A. F. Post, I. Joint, and N. H. Mann. 2005. Genetic diversity of marine Synechococcus and co-occurring cyanophage communities: evidence for viral control of phytoplankton. Environ. Microbiol.7:499-508. 6. Safferman, R. S., T. 0. Diener, P. R. Desjardins, and M. E. Morris. 1972. Isolation and characterization of AS-1, a phycovirus infecting the blue-green algae, Anacystis nidulans and Synechococcus cedro- rum. Virology 47:105-113. 7. Safferman, R. S., and M. E. Morris. 1964. Growth characteristics of the blue-green algae virus LPP-1. J. Bacteriol. 88:771-775. 8. Samimi, B. Drews, G. Adsorption of Cyanophage AS-1 to Unicellular Cyanobacteria and Isolation of Receptor Material from Anacystis nidulans, Journal of Virology, Jan. 1978, p. 164-174 9. Suttle, C. A.2000. Cyanophage and their role in the ecology of cyanobacteria, p. 563-589. In B. A. Whitton and M. Potts (ed ), The e- cology of cyanobacteria: their diversity in time and space. Kluwer Academic Press, Dordrecht, The Netherlands. 10. Thingstad, T. F.2000. Elements of a theory for the mechanisms controlling abundance, diversity', and biogeochemical role of lytic bacterial viruses in aquatic systems. Limnol. Oceanogr.45:1320- 1328. 11. Weinbauer, Markus G. (2003) Ecology of prokaryotic viruses, FE- MS Microbiology Reviews 12. Whitton, B. A., and M. Potts (ed.).2000. The ecology of cyanobacteria: their diversity in time and space. Kluwer Academic Press, ,0Dordrecht, The Netherlands. 13. Wiegand, C., Pflugmacher, S. (2004) Ecotoxicological effects of selected cyanobacterial secondary' metabolites a short review, Toxicology and Applied Pharmacology 14. Wommack, K. E., and R. R. Colwell.2000. Virioplankton: viruses in aquatic ecosystems. Microbiol. Mol. Biol. Rev.64:69-114. 15. Yoshida, T., Y. Takashima, Y. Tomaru, Y Shirai, Y. Takao, S. Hiroishi, and K. Nagasaki.2006. Isolation and characterization of a cyanophage infecting the toxic cyanobacterium Microcystis aeruginosa. Appl. Environ. Microbiol. 72:1239-1247.
