Hidrológiai Közlöny, 2014 (94. évfolyam)
2014 / 4. szám - Tóth Szilvia - Surányi Gyula: Cianotoxin-cianofág-gazdasejt kölcsönhatások vizsgálatai laboratóriumi modellrendszerben
31 Cianotoxin-cianofág-gazdasejt kölcsönhatások vizsgálatai laboratóriumi modellrendszerben Tóth Szilvia1, Surányi Gyula2 ‘Kisvárdai Bessenyei György Gimnázium és Kollégium, 4600.Kisvárda, Iskola tér 2. 2Debreceni Egyetem TTK BŐI Növénytani Tanszék, 4032, Debrecen, Egyetem tér 1. zgysuranyi@gmail.com Kivonat: A természetes élőhelyeiken a cianobaktériumok mellett gyakran kimutathatók a cianofágok is. A fágfertőzés a fiziológiás stresszválaszok közé sorolható komplex hatás, amely a gazdasejt anyagcseréjének, energiaellátásának kulcsfontosságú szintjeit érinti. Kiválasztott modellrendszerünkben [Synechococcus sp PCC 6301 gazdasejt-AS-lcianofág] a mikrocisztin-LR cianotoxin fágok életképességére, a fággal fertőzött tenyészetek növekedésére és a fágcíklus alatt végbemenő fehérjeszintézisre gyakorolt hatását vizsgáltuk. A gazdasejt stresszválaszában és a fágciklusban is a- lapvető jelentőségű fehérjeszintézis változásainak nyomon követése radioaktívan jelölt prekurzorok felhasználásával történt Bármilyen sorrendben kapcsoltuk össze a mikrocisztin kezeléseket és a fágfertőzéseket, a kölcsönhatás nem gátolta meg a fágfehérjék szintézisét A fágfehérjék mennyisége azonban a toxinkezelés hatására megváltozott, csökkent, de csak abban az esetben, ha a toxinkezelés megelőzte a fágfertőzést Modellrendszerünkben az interakciót alapvetően befolyásoló tényező a fágmultiplicitás és a toxinkoncentráció volt. Kulcsszavak: cianofág, stresszválasz, fágmultiplicitás, mikrocisztin-LR, fehérjeszintézis, Bevezetés A cianobaktériumok olyan, rendkívül változatos és számos előfordulási hellyel rendelkező prokarióta organizmusok, amelyek oxigént fejlesztő fotoszintézisük, nitrogénkötésük, vagyis fotoautotróf fiziológiájuk révén mind ökológiai mind evolúciós szempontból meghatározó szerepet játszanak (1,12). A természetes vizekben bekövetkező trófikus változások meghatározó szereplői a cianobaktériumok, amelyek a környezeti feltételek számukra optimális változásakor a felszíni vizekben felszaporodnak és ún. vízvirágzásokat okoznak. A vízvirágzásokban számos leírt esetben olyan cianobaktérium volt a domináns faj, amely toxikus másodlagos anyagcsereterméket, cianotoxint termelt (2,13). A prokarióta cianobaktériumok közül többnek, hasonlóan a heterotróf baktériumok bakteriofágjaihoz, cianog- fágja van, amely a gazdasejt anyagcseréjét, a fágadszorp- ciót követően alapvetően „átprogramozza”, ezt a komplex változást fágciklusnak nevezzük. A fágciklus végeredménye számos esetben a gazdasejt szétesése lízise lehet. (6,7,8,9,14,15). A szakirodalomban több olyan vízvirágzást is bemutattak, amelyek „összeomlásakor”, azzal párhuzamosan a víztérben bekövetkező cianofág titer növekedést figyeltek meg. A vízvirágzás végén bekövetkező cianofág koncentráció emelkedést olyan esetben is kimutattak, amikor a vízvirágzást kiváltó faj(ok) között cianotoxint termelő törzs(ek) fordult(ak) elő (4,5,10,11,14). Anyag és módszer A kísérletekben gazdaszervezetként Synechococcus sp. PCC 6301 törzsből készült tenyészetet (5% C02-t tartalmazó, sterilre szűrt levegővel buborékoltatott, 39§C-os víz-fürdőben, 200 éE m"2 s'1 fényen) neveltünk, amelynek generációs ideje 6-7 óra volt. A tenyészetek sejtszám -növekedését Bürker-kamrában történő sejtszámolással és optikai úton, 800 nm-en leolvasott fényabszorpció változással követtük nyomon. A kísérletekben differenciál centrifugálással (Beckman Avanti JA-20 rotor, 4§C, 30 perc, 39000 g) tisztított és koncentrált AS-1 lizátumot használtunk. Az AS-1 fág- partikulumok milliliterenkénti számát (plakk képző egység) Safferman módosított módszerével (6) határoztuk meg. Az így nyert AS-1 koncentrátum 2-3 nagyságrenddel nagyobb fágtitert mutatott, mint a lizátum. A kísérletekben a tisztított mikrocisztin-LR-t 25 pg/ ml kezelési végkoncentrációban használtuk. A fehérjék pulzusjelölésének (S35-metionin) időtartama 60 perc (3. ábra) vagy 30 perc (4. és 5. ábra) volt. A tenyészetek fehérjetartalmát 80 %-os hűtött acetonnal kicsaptuk, a csapadékot centrifugálással (Heraeus Biofuge pico, 13000 rpm, 20 perc, 4 §C) ülepítettük, vákuumban szárítottuk és 25pl 2x töménységű mintafeltáró puffer- ben vettük fel. A fehérjeminták gélelektroforézisét Lae- mmli módosított módszerével (3) végeztük el. Eredmények A mikrocisztin-LR cianobakteriális fágfertőzésekre gyakorolt hatását a Synechococcus sp. PCC6301 gazdasejt AS-1 jelű cianofággal fertőzött tenyészeteiben vizsgáltuk (8). A kétszeres cianofág multiplicitással fertőzött gazdasejt tenyészetekben a sejtek lízise 360-420 perc között vált teljessé, ezzel véget ért a fágciklus, amelyet a tenyészetek OD800 nm-en mért fényadszorpciójával követtünk nyomon (1. ábra). Külön vizsgáltuk az ún. fágkont- rollokat, majd különböző sorrendben hajtottuk végre a fágfertőzés-mikrocisztin kettős kezeléseket. Az 1. ábrán bemutatottak szerint kísérleti körülményeink közt a mikrocisztin nem befolyásolta szignifikánsan a fágfertőzött tenyészetek növekedését, a gazdasejtek lízise a fágkont- rollokéval azonos időpontban/végpontban bekövetkezett. A felszíni vízterekben kialakuló vízvirágzások során a fágkoncentráció nagy valószínűséggel nem érheti el azt az értéket, amely a gazdasejt fertőzésekor a kétszeres fágmultiplicitást lehetővé tenné. Kísérleti rendszerünkben ezért a fágmultiplicitás értékét egyszeresre csökkentettük, a mikrocisztin-LR koncentrációt (25 pg/ml), a fágfertőzések és mikrocisztin-kezelések vizsgálati kombinációit változatlanul hagytuk. Az egyszeres fágmultiplicitással AS-1 cianofággal fertőzött és a mikrocisztinnel kezelt és fággal fertőzött, ún. kettős kezelésű tenyészetek optikai denzitásának mérése alapján (2. ábra) kimutattuk, hogy a fágciklusban e- gyik kezelési kombináció alkalmazásakor sem lehetett a fágciklus végbemenetelét teljesen meggátolni, mert a lí- zis bekövetkezett, de a fágciklus kinetikáját a mikrocisztin módosította és a cianofág hatására bekövetkező teljes lízis időpontja is eltolódott (2. ábra). A fágciklus kulcslépései (a fág-adszorpció és genom integráció) a gazdasejt anyagcseréjét „átprogramozzák”. Az előbbi kulcslépések egyben a mikrocisztin potenciális hatóhelyeit is jelenthetik az AS-1 cianofág-Synechococcus sp. PCC6301 gazdasejt-mikrocisztin kölcsönhatásban. Modellrendszerünkben az AS-1 adszorpciója 30
