Hidrológiai Közlöny 2012 (92. évfolyam)
2. szám - Kováts Nóra–Ács András–Ferincz Árpád–Kakasi Balázs–Kovács Anikó: Lumineszcens baktériumteszt egyes változatainak alkalmazása üledék-toxicitás vizsgálatára
35 Lumineszcens-baktérium teszt egyes változatainak alkalmazása üledéktoxicitás vizsgálatára Kováts Nóra - Ács András - Ferincz Árpád - Kakasi Balázs - Kovács Anikó Pannon Egyetem, Limnológia Tanszék, 8200, Veszprém, Egyetem u. 10. Kivonat:Üledékek ökotoxicitásának értékelésére általánosan alkalmazott teszt a Vibrio fischeri biolumineszcencia-gátláson alapuló vizsgálat. A teszt eredeti változata vizes fázis vizsgálatára használható, ez a fázis üledék esetében pórusvíz, ill. kivonat. Egyik sem reprezentálja ugyanakkor az üledékszemcséken erősen kötődő szennyezőanyagok toxicitását. Ennek kiküszöbölésére a V. fischeri toxicitás tesztnek léteznek ún. direkt kontakt teszt változatai, amelyek esetében a tesztszervezet direkt kontaktusban van a szennyezett közeggel. A direkt kontakt teszteknek legújabb változata, a 2010-ben szabványszintre emelkedett Flash teszt kinetikus mérést valósít meg, lehetővé téve a minta színéből ill. a benne levő lebegő részecskékből adódó virtuális toxicitás kiküszöbölését. A fejlesztések másik irányzata olyan rekombináns baktériumok alkalmazása, amelyek szintén biolumineszcenciára képesek, ill. egyedi szennyezőkre mutatnak érzékenységet. Kulcsszavak: üledéktoxicitás. Vibrio fischeri, Microtox, Flash teszt, rekombináns baktérium. Bevezetés Denis, 2002; Viguri et al., 2007; Coz et al., 2008; Macken et Üledékek ökotoxicitásának értékelését, felmérését számos al., 2008; Dauvin, 2010). tényező nehezíti meg. Ezek között szerepel az üledék térbeli (horizontális és vertikális) heterogenitása, ill. magának a szenynyezettségnek a komplexitása. A gyakorlatban általában többféle szennyező komponens keverékével kell számolni, amelyeknek nemcsak az ökotoxicitása lehet eltérő, hanem a környezetben mutatott viselkedése (pl. bomlása, adszorpciója az üledékrészecskéken, felvehetősége, bioakkumulációra való hajlama, stb.). Éppen ezért a gyakorlatban az üledékminták ökotoxicitásának vizsgálatát nem egy, hanem többféle teszttel végezzük, amelyek leggyakrabban eltérő fajba tartozó tesztorganizmusokkal végzett vizsgálatok. Egy másik megközelítésmód szerint az üledékmintát különböző mátrixként kezeljük, ill. készítjük elő a tesztelésre: alkalmazhatunk ún. direkt kontakt teszteket, amikor is a tesztszervezet és az üledék tényleges, fizikai kontaktusban vannak egymással, alkalmazhatjuk tesztmátrixként a pórusvizet ill. az (általában szárított) üledékből kivonatot készíthetünk (különböző kivonószerekkel). Az első esetben a teljes üledék toxicitását elemezzük, általában üledéklakó szervezetekkel, míg a másik két esetben vizes fázis lesz a tesztközeg, és valamilyen vízi organizmust alkalmazunk tesztszervezetként. Hatékonyság szempontjából a leggyakrabban alkalmazott tesztszervezet a Vibrio fischeri. Biolumineszcens, Gram negatív baktérium, a szervezetet ért toxikus hatás a fénykibocsátás csökkenését eredményezi. A gátlás mértéke arányos a toxikus hatás erősségével, és jól számszerűsíthető végpont, mivel a fénykibocsátás egy megfelelően kialakított luminométerrel mérhető. A tesztet 1981-ben kezdte el forgalmazni a Beckman Instruments, ennek továbbfejlesztett és standardizált változata jelenleg Microtox néven szerepel a piacon (Microbics Corporation, Carlsbad, CA ill. újabban Azur Environmental) (Bulich és Isenberg, 1981). Üledékek ökotoxicitásának minősítése során egyre elterjedtebb az a gyakorlat, hogy a három mátrixot egymással párhuzamosan vizsgálják, az üledék szennyezettségének mértékéről, a szennyező anyagok várható viselkedéséről komplementer információkat kapva. Többnyire többféle mátrixot és többféle tesztszervezetet alkalmaznak: így pl. Wang et al. (2009) kivonatra V. fischeri (baktérium) és Selenastrum capricornutum (alga), a teljes üledékre Heterocypris incongruens (kisrák) teszteket; Lahr et al. (2003) pórusvízre V. fischeri, Brachionus calycifiorus (kerekesféreg) és Thamnocephalus platyurus (kisrák), teljes üledékre pedig Chironomus riparius (árvaszúnyog) teszteket. Ezek a munkák azért viszonylag nehezen összevethetők, mivel az egyes minták tényleges toxikussága függ az adott szenynyező várható környezeti viselkedésétől (azaz hogy melyik mátrixot alkalmazzuk) és a tesztszervezet érzékenységétől. Több olyan munka is található ugyanakkor, amelyek esetében a tesztszervezet megegyezik (a Vibrio fischeri), ugyanazon üledékmintából többféle mátrixon alkalmazva (pl. Ribera és Saint Pórusvíz és kivonat vizsgálata A V. fischeri biolumineszcencia-gátláson alapuló tesztet eredetileg vizes fázis elemzésére fejlesztették ki, hazánkban a releváns szabványok: MSZ EN ISO 11348-1:2000: Vízminőség. Vízminták gátló hatásának meghatározása a Vibrio fischeri fénykibocsátására (lumineszcensbaktérium-teszt). 1. rész: Vizsgálat frissen előkészített baktériumokkal; MSZ EN ISO 113482:2000: Vízminőség. Vízminták gátló hatásának meghatározása a Vibrio fischeri fénykibocsátására (lumineszcensbaktériumteszt). 2. rész: Vizsgálat folyadékból szárított baktériumokkal és az MSZ EN ISO 11348-3:2000: Vízminőség. Vízminták gátló hatásának meghatározása a Vibrio fischeri fénykibocsátására (lumineszcensbaktérium-teszt). 3. rész: Vizsgálat fagyasztva szárított baktériumokkal szabványok alapján). Értelemszerűen pórusvíz, ill. kivonat vizsgálatára alkalmazható. A teszt elvégzésére több, kereskedelmi forgalomban kapható rendszer létezik: Microtox (AZUR Environmental), ToxAlert (Merck), LUMlStox (Hach Lange), BioTox (ABOATOX). A mérés elvégzéséhez először a baktérium szuszpenziót kell elkészíteni, fagyasztva/folyadékból szárított baktérium és ún. rekonstituciós oldat felhasználásával. A módszer elve, hogy először megmérjük a baktériumszuszpenzió lumineszcencia intenzitását (RLU - relatíve luminescence unit), a baktériumszuszpenzióhoz ezután hozzáadjuk a mintaoldatot, majd megfelelő inkubációs idő (expozíciós idő) után ismételten méijük a lumineszcencia intenzitását. Az expozíciós idő max. 30 perc. A fénykibocsátás gátlását ebben az esetben mindig egy abszolút kontrollhoz képest kapjuk meg. Illusztrációképpen a ToxAlert £100 által alkalmazott számítási módot ismertetjük. A műszer először az fk, korrekciós faktort számolja ki a mért lumineszcencia-intenzitásból ([1] egyenlet). fk, = lk, / 10 (t = 30 perc) [1] fk, az expozíciós (kontakt) időre megadott korrekciós faktor lk, lumineszcencia intenzitás a kontroliban, RLU-ban (relative luminescence units) mérve, az expozíciós idő után 1 0 a kontroll tesztszuszpenzió lumineszcencia intenzitása közvetlenül a hígító (2%-os NaCl) oldat hozzáadása előtt. A korrekciós faktor alkalmazásával az egyes tesztminta küvettára kiszámolja 1 0 korrigált értékét ([2] egyenlet). l c,= l 0xfk, [2] fk, az fk, értékek átlaga 1 0 a kontroll tesztszuszpenzió lumineszcencia intenzitása közvetlenül a hígító (2%-os NaCl) oldat hozzáadása előtt l c, az 1 0 korrigált értéke a tesztminta küvettákra közvetlenül a tesztminta hozzáadása előtt. Ezek után a tesztminta H, inhibeáló effektusát számítja ki ([3] egyenlet). H, =[(1o-1T./1C)]x100 [3] H, a tesztminta inhibeáló effektusa az expozíciós idő után, %-ban megadva l c, az 1 0 korrigált értéke a tesztminta küvettákra közvetlenül a tesztminta hozzáadása előtt
