Hidrológiai Közlöny 2012 (92. évfolyam)
2. szám - Kováts Nóra–Ács András–Ferincz Árpád–Kakasi Balázs–Kovács Anikó: Lumineszcens baktériumteszt egyes változatainak alkalmazása üledék-toxicitás vizsgálatára
36 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2012. 92. ÉVF. 2. SZ. l T t a tesztminta lumineszcencia intenzitása az expozíciós idő után. Általánosan elfogadott, hogy a pórusvíz az egyes szennyezők vízoldható, biológiailag hozzáférhető frakcióját tartalmazza, ill. ezek toxicitásáról adhat információt (Carr, 1998; Nipper et al., 2002), míg kivonat készítésével egyes beavatkozások (pl. kotrás) során történő mobilizációs folyamatokat lehet reprezentálni (Macken et al., 2008). A kivonat alkalmazhatósága nagymértékben függ a szennyező anyagok jellegétől, minőségétől is. Antunes et al. (2010) pl. peszticidek (klórpirifosz, glifozát, vinklozolin, endoszulfán) koncentrációját vetette össze szilárd mátrixban ill. az ebből készített kivonatban, és azt tapasztalta, hogy a szilárd mátrixhoz képest a kivonat lényegesen kisebb koncentrációban tartalmazta ezeket a vegyületeket, és ennek megfelelően a V. fischeri teszt sem mutatott ki toxicitást. Direkt kontakt teszt A direkt tesztek esetében a tesztszervezetet az üledékben vizsgáljuk, közvetlen kontaktust valósítunk meg az organizmus és az üledék szilárd részecskéi között. A V. fischeri biolumineszcencia-gátláson alapuló ökotoxicitás-vizsgálatnak olyan változatai is ismertek, amelyek direkt kontakt tesztként működnek. Elsőként Brouwer et al. (1990) és Tung et al. (1990) egymástól függetlenül dolgoztak ki egy ilyen jellegű tesztprotokollt. A Microtox® Solid Phase Test (Azur Environmental) alapelve, hogy az üledékből több hígításban szuszpenzió készül, ehhez adják hozzá a tesztbaktériumokat, majd a megadott expozíciós idő után a szilárd frakciót szűréssel eltávolítják. A rendszer tulajdonképpen a fennmaradó vizes fázissal dolgozik. A baktériumok lumineszcenciáját megmérjük, és összehasonlítjuk az üledék nélküli kontrollal. A szűrés során ugyanakkor előfordulhat, hogy a szilárd frakción megtapadó baktériumok is eltávoznak, a vizes fázisban csökken a baktériumsűrűség, amely alacsonyabb fénykibocsátást eredményez (Benton et al., 1995; Ringwood et al., 1997). A Basic Solid-Phase Test (BSPT) egy egyszerűbb és gyorsabb eljárás, mint a Solid Phase Test. A korábbi Solid Phase Teszttel (SPT) ellentétben, a BSPT eljárás esetén nincs szükség a szilárd fázis leszűrésre. Az üledék mintákat előzőleg egyszerűen le kell szitálni egy 0,250mm lyukbőségű szitán, majd hozzá kell adagolni a 35 g/l koncentrációjú NaCl oldatot, és különböző hígításokat készítünk belőle. A kezdeti fénykibocsátás mérése a 15°C-on készül a baktérium szuszpenzióról, majd az 10 felvétele után a különböző hígításokat hozzá adagoljuk a baktérium szuszpenzióhoz. A fényleolvasás a 30. percben történik, majd az eredményt EC50 értékként adhatjuk meg. (Azur Environmental, 1995) A BSPT eljárás során a V. fischeri baktériumok vizes szuszpenzióban direkt kontaktusba kerülnek a szilárd fázissal. Azonban a metódus fő hátránya az, hogy a minta turbiditása ami a luminométeres mérések során is fennáll, módosíthatja a baktériumok fény kibocsátás mértékét, ezzel magasabb toxicitás értékeket indukálva. A minta lebegőanyagtartalmának zavaró hatását a V. fischeri baktériumokra nézve több luminométer rendszeren tanulmányozták (Lappalainen et al., 1999, 2001; Campisi et al., 2005), a teszt standardizálhatóságának érdekében. A Lappalainen et al. (1999, 2001) által kidolgozott protokoll szintén üledékszuszpenzióval dolgozik, itt viszont a tesztbaktériumok a mérés teljes ideje alatt a szuszpenzióban maradnak. Mivel a szuszpenzióban jelen lévő valamilyen szín, vagy feloldatlan szemcsék Tyndall szórása gyengíti a baktériumok által kibocsátott lumineszcens fényt, még nem toxikus minta esetén is csökkentett fénykibocsátást tapasztalnánk, amely virtuális toxicitást eredményezne. A protokoll ezt úgy korrigálja, hogy az egyes minták fénykibocsátásának csökkenését abszolút kontroll nélkül értékeli, azaz a gátlást adott minta esetében a 0. időpillanatban és az expozíciós idő letelte után mutatott fénykibocsátás alapján számítja: KF = ICjo/ICO INH% = 100 - 100 x (IT 3 0 / KF x IT 0): KF = korrekciós faktor IC 3 0 = a kontroliban mért lumineszcencia-intenzitás 30 perc expozíció után, RLU-ban kifejezve IC 0 = a kontroliban mért kezdeti lumineszcencia-intenzitás, RLU-ban kifejezve IT 3 0 = a mintában mért lumineszcencia-intenzitás 30 perc expozíció után, RLU-ban kifejezve IT 0 = a mintában mért kezdeti lumineszcencia-intenzitás, RLU-ban kifejezve. Látható, hogy a kontroliban mért fénykibocsátás értékére csak a korrekciós faktor kiszámításához van szükség. A protokoll, ill. az erre épülő, a finn Aboatox Co. által forgalmazott Ascent Luminométer további novum jellege a toxicitás kinetikus mérése (Lappalainen et al., 1999). Miután a baktérium-szuszpenzióhoz hozzáadjuk a mintát, a készülék az ezt követő 30 másodperces időszakban folyamatosan rögzíti a fénykibocsátás jellegét és lefutását. A kontroliban a baktériumok felvillannak (a rendszer rövid neve éppen ezért Flash System), a fénykibocsátás pedig közel állandó szinten marad. Toxikus közegben a baktériumok felvillannak, majd a minta gátló hatására gyakorlatilag azonnal (még a 30 mp-es intervallumon belül) fénykibocsátás-gátlás következik be. Zavaros (sötét), de nem toxikus mintában a kontrollhoz képest eleve alacsonyabb a kezdeti fénykibocsátás, azonban ez utána közel állandó marad. Végül a zavaros (sötét), de toxikus mintában a kontrollhoz képest eleve alacsonyabb a fénykibocsátás, ami a kezdeti felvillanást követően a toxikus hatásra lecsökken, tapasztalható tehát a toxikus mintákra általánosan jellemző csúcs (/. ábra). A minta toxikus jellege tehát már 30 mp-es expozíció során becsülhető, számszerűsíthető, Mortimer et al. (2008) pl. ezt a megközelítést alkalmazta nanorészecskék toxicitásának becslésére. Bár maga a szabvány új, a Flash rendszert sikeresen alkalmazták szennyezett talajok és üledékek által jelentett ökológiai kockázat értékelésére (Pollumaa et al., 2000, 2004; Heinlaan et 1. ábra: Fényintenzitás időbeni lefutása Rekombináns baktériumok mint tesztszervezetek A Vibrio fischeri lumineszcencia gátláson alapuló teszt továbbfejlesztésének tekinthetők azok a rekombináns bioszenzorok, amelyekben a lac promoter géneket a luxCDABE génekkel kapcsolták össze (lac::luxCDABE fúzió). A luxCDE gének egy enzimkomplexet kódolnak (zsírsav reduktáz, szintetáz és transzferáz), amelyek a szubsztrátot (zsírsavat) szintetizálják a luciferáz számára, míg a luxAB gének a luciferázt kódolják. A recipiens szervezet Escherichia coli. Hasonlóképpen az eredeti V. fischeri teszthez, a toxikus minta a biolumineszcencia gátlását okozza. Ismertek olyan E. coli bioszenzorok, amelyekben a luxCD ABE gén operont fuzíonáltatják ún. stressz promóterekkel. (Van Dyk et al.,1994; Belkin et al.,1997; Min et al., 1999; Gil et al.,2000; Choi&Gu 2002, Miché et al - 2003). A toxikus anyag szubletális koncentrációja a stressz promoter indukcióján keresztül a lux gének transzkripcióját váltja ki, amely fénykibocsátást indukál. Számos stressz promótert alkalmaznak: rec
