Hidrológiai Közlöny 2011 (91. évfolyam)

6. szám - LII. Hidrobiológus Napok: „Alkalmazott hidrobiológia” Tihany, 2010. október 6-8.

39 Toxintermelő PL A NKTO Til RIX cianobaktérium fajok és PRYMNESIUM PAR VUM (HAPTOPHYTA) azonosítása molekuláris markerekkel Farkas Oszkár, Mosolygó Ágnes, Horgos Tamás, Vasas Gábor Debreceni Egyetem TEK-TTK Növénytani Tanszék, 4032. Debrecen, Egyetem tér 1. Kivonat:Az édesvizekben előforduló toxikus vízvirágzások okozói elsősorban egyes cianobaktériumok fajok közül kerülnek ki. A leggyakoribb cianobakteriális toxinok a ciklikus heptapeptid mikrocisztin (MCY) variánsai, amelyeket több genus is termelhet. Az adott cianobaktériumfaj toxintermelő kemotípusai, külső megjelenési sajátosság alapján nem különíthető el toxint nem termelő fajtársaitól. Több magyarországi víztérben Planktothrix cianobaktérium-fajok által előidézett vízvirágzást figyeltünk meg, így aktuálissá vált a Planktothrix fajok toxintermelő képességének rutinszerű analízise. A mikrocisztin szintézist irányító génklaszter (MCY operon) több elemére tervezett primer segítségével a toxintermelő típusokat sikerült elkülöníteni a toxint nem termelő variánsoktól. A magyarországi félszíkes vizek jellegzetes képviselője a Prymnesium parvum alga amelynek tömeges elszaporodása, ahogyan korábban mi is beszámoltunk róla komoly halpusztuláshoz vezethet. Természetes vízmintából a GDP mannóz pirofoszforiláz, szinaptobrevin, fukokszantinklorofil a/c kötő fehérje és a glutation-S transzferáz génekre tervezett primerekkel multiplex PCR módszerrel sikeresen azonosítottuk a faj jelenlétét. Kulcsszavak: Planktothrix, Prymnesium parvum, mcy-gén, vízvirágzás.. Bevezetés A toxintermelő algák, cianobaktériumok tömeges elszaporodása felszíni vízterekben gyakran vezetnek természetvédelmi, környezet-egészségügyi és gazdasági problémákhoz. A jelenséget édesvízi és tengeri élőhelyeken is megfigyelték a Föld számos országában. A probléma kialakulásának tényleges okai nehezen általánosíthatóak, figyelembe véve, hogy a jelenséget több algataxon képviselői idézhetik elő sajátos megjelenési, fiziológiai jellemzőkkel (Reynolds és mtsai. 1975). Ugyanakkor számos tanulmány felhívja a figyelmet a felszín alatti és felszíni vízkészleteinket ért nagymértékű szervetlenanyag-terhelésre és egyes éghajlati viszonyok megváltozására, amelyek a tárgyalt tömegprodukciók kialakulását elősegíthetik. Nemcsak az egyes vízvirágzások kialakulásához vezető problémák lehetnek egyediek, a vízvirágzások kialakulásért felelős szervezetek toxintermelési viszonyai, jellemzői sem általánosíthatóak, köszönhetően az algatoxintermelés speciális jellemzőinek. A toxicitásért felelős különböző anyagcseretermékek hatásai, kémiai jellemzői, genetikai háttere igen nagy változatosságot mutatnak különböző algaszervezetekben. A mérgező anyagcsere-termékek között találunk lineáris illetve ciklikus peptideket, alkaloidokat, lipopoliszacharidokat, fehérjéket, polién-poliétereket, amelyek szerkezeti heterogenitásaiból adódóan változatos hatásmechanizmussal és hatáserősséggel rendelkeznek (Welker és mtsai. 2006). Nagyban bonyolítja a helyzetet, hogy egy toxint több algataxon képviselője is termelheti, valamint egy adott szervezet több toxint is termelhet. Fontos felhívni a figyelmet, hogy a toxintermelés nem köthető adott fajhoz hiszen egy adott faj különböző populációja, különböző izolátuma kapcsán számolhatunk azzal hogy toxintermelő, de azzal is hogy mérgező anyagcsere-terméket nem termel. Egy adott fajhoz tartozó egyedek toxintermelő és toxint nem termelő kemotípusa nem különíthető el külső jellemzők, morfológiai sajátosság alapján, azaz egyszerű fénymikroszkópos analízissel a probléma nem oldható meg (Welker és mtsai. 2007). A toxintermelés legbiztosabb igazolása a mérgező metabolit, az algatoxin közvetlen mérése analitikai módszerekkel, amely megközelítés ugyan rejt magában néhány problémát (pl. új eddig nem ismert toxinok, toxinvariánsok kimutatásának nehézsége), mégis az egyik legbiztosabb út a toxintermelés igazolására illetve kizárására. A megközelítés ugyan a legbiztosabb, de számos modern műszeres-analitikai eszköz, módszer meglétét ismeretét igényli (Fastner és mtsai. 1999, Vasas et al. 2004) Aktuális és igen fontos törekvés az algatoxintermelés hátterének megértése, amihez elengedhetetlen egyes molekuláris biológiai módszerek alkalmazása. Az elmúlt években a legismertebb cianobakteriális toxinok termeléséhez szükséges génklaszterek leírásra kerültek, amelyek alapján célzottan tervezett primerek segítségével egyes toxinspecifikus gének analízise rutinszerűen elvégezhető. A toxintermelés valamint a toxintermelő képesség igazolása molekuláris markerek segítségével fontos és alapvető eszköz lehet az algák, cianobaktériumok toxintermelésének teljes megértéséhez, hiszen a problémakörben számtalan kérdés megválaszolatlan. A leggyakrabban előforduló cianobakteriális toxin a mikrocisztin, amelynek számos variánsát írták már le. A proteinfoszfatáz-gátló hatással bíró ciklikus peptid hét aminosavból épül fel, és az egyes aminosavak variabilitásából adódóan már több mint száz variánst írtak le értelemszerűen változatos molekulatömeggel és hatáserősséggel. Mikrocisztin-termelő kemotípusokat írtak le a Microcystis, Anabaena és a Planktothrix genus fajai esetében. A termelésért a peptid-szintetáz (PS), poliketidszintáz (PKS) enzimrendszer felelős, amelyet kódoló gének folytonos mikrocisztin-szintetáz klaszterbe csoportosulnak. A klaszter hasonló elemekkel, de eltérő elrendezéssel jelenik meg a különböző genuszba tartozó mikrocisztin-termelő fajokban (Mbedi és mtsai. 2005). A prokarióta cianobaktériumok mellett hazánkban is megfigyelhető egyes eukarióta algafajok tömeges elszaporodása. Toxintermelésüket és azok következményeit megvizsgálva egyértelműen a haptophyta Prymnesium parvum más néven aranyalga tekinthető a legveszélyesebb szervezetnek víztereinkben. Az aranysárga elszíneződést okozó algafaj leginkább nagy vezetőképességgel rendelkező félszikes vizekben szaporodik el tömegesen. 20 000-40 000 egyed/ml-es egyedszám esetén a következmények végzetesek lehetnek az adott víztér halfaunájára nézve, hiszen az algatömeg által termelt komplex toxinkeverék következtében a halak keringése és oxigénháztartása felborul és tömeges pusztuláshoz vezet (Shilo, 1981). Célunk a mikrocisztin szintézist irányító génklaszter (MCY operon, 1. ábra) több elemére tervezett primer segítségével a toxintermelő Planktothrix típusokat elkülöníteni a toxint nem termelő variánsoktól. Célunk volt továbbá a természetes vízmintából a GDP mannóz pirofoszforiláz, szinaptobrevin, fokokszantin-klorofil a/c kötő fehérje és a glutation-S-transzferáz génekre tervezett primerekkel multiplex PCR módszerrel igazolni az aranyalga (P. parvum) jelenlétét. Anyag és módszer Mintavétel: Vizsgálataink során Planktothrix rubescens és P. agardii tömegprodukcióból gyűjtöttünk sejttömeget, amit fagyasztás és fagyasztva-szárítás után tároltunk. A mintavételi helyeket az l-es táblázatban foglaltuk össze. A Prymnesium parvum tartalmú mintát 2010-ben a makói dögös-tóból gyűjtöttük. 2 liter merített vízmintát centrifugálással tömörítettük. Toxinanalízis: A mikrocisztinek sejttömegből történő mérésére, meghatározására két módszert alkalmaztunk. A gyors analízist kapilláris elektroforézissel végeztük az általunk kidolgozott módszer szerint. A toxin jelenlétének megerősítésére illetve azonosítására MALDI-TOF tömegspektormetriás analízist végeztünk. PCR vizsgálatok: A Planktothrix fajok mcy gének analíziséhez Mbedi és mtsai által ajánlott primereket és körülményeket alkalmaztuk. A P. parvum PCR vizsgálatát Schomna et al. alapján végeztük (Schomna et al. 2010).