Hidrológiai Közlöny 2011 (91. évfolyam)
6. szám - LII. Hidrobiológus Napok: „Alkalmazott hidrobiológia” Tihany, 2010. október 6-8.
40 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2011. 91. ÉVF. 6. SZ. Eredmények és megbeszélésük A környezeti planktonminták vizsgálata során a cianotoxinok bioszintézisét meghatározó gének detektálása és a kifejeződést befolyásoló tényezők (belső és külső környezeti faktorok) kimutatása fontos a cianotoxin-termelés mechanizmusának megértésében, de a monitorozásban, a toxikus vízvirágzás előzetes kimutatásában is. A különböző vizes élőhelyekről begyűjtött környezeti mintákban vizsgáltuk a mcy gének jelenlétét. Kísérleteink olyan kiválasztott mcy gének detektálására irányultak, amelyek kulcsfontosságú szerepet töltenek be a mikrocisztin bioszintézisében. Ezek a gének a mcy A, mcyB, mcyCJ, mcyE, mcyEG, mcyHA, mcyT és mcyTD, lokalizációjuk az 1. ábrán látható. T mcyO mcyE mcyO mcy 11 mcyA mcyB mcyCJ 1. ábra. A vizsgált mcy-gének lokalizációja a Planktothrix mcyklaszterben. A PCR vizsgálatokat a környezeti minták felhasználásával végeztük, melyek gyűjtési helyeit és fajneveit az 1. táblázat szemlélteti. A mikrocisztintermelő szervezetek toxin-szintézisének feltétele, hogy a mcy klaszter megfelelő elemei jelen legyenek a genomban. Ha a klaszter egyes génjei mutálódnak illetve inaktívvá válnak, a bioszintézis leállhat vagy a toxintermelés mértéke lecsökken. Ez a jelenség az általunk vizsgált tömegprodukciók esetén is megfigyelhető. A Planktothrix rubescens és a várpalotai Planktothrix agardhii törzsek toxintermelő szervezetek, a mcy génklaszter hiánytalan. A többi minta esetén nem figyelhettünk meg toxintermelést, illetve a klaszter egyes génjeinek hiányát tapasztaltuk. A Hősök-tavából (Gyula) izolált P. agardhii esetében mcyCJ hiányról beszélhetünk, amely esetében kondenzációs, adenilációs, tiolizációs, tioészteráz és O-metiltranszferáz domének tűnnek el a peptid-szintetáz rendszerből. A mcyJ gén modifikáló és vágó funkciókat kódol a mikrocisztin bioszintézisben. A gén hiányában nem történik meg a metilcsoportok átvitele az Adda oldalláncára, illetve a deléció ismeretlen mikrocisztinek képződéséhez vezet. A hajdúhadházi mintákban az előbb ismertett mcyCJ génen kívül a mcyE és a mcyHA gének is hiányoznak. McyE hiány ketoacilszintáz, aciltranszferáz, acil-szállító fehérje, aminotranszferáz, kondenzációs, adenilációs, tiolizációs funkciók elvesztésével jár. Az aminotranszferáz dómén nagyon hasonló a glutamát szemialdehid aminotranszferáz doménhez, amely a mikroginin génklaszter eleme, és az aminocsoport Adda oldalláncra való átvitelben vesz részt. A mcyH legfőbb szerepe a mikrocisztin aktív transzportja. A mcyA sajátossága a klaszteren belül az epimerizációs funkció, amit csak ez a gén tartalmaz, megléte esszenciálisnak tekinthető a mikrocisztin szintézis szempontjából. McyA deléciója során leáll a D-aminosav szintézis. A KisBalatonból származó törzsek mcy génklaszteréből a mcyA, mcyB, mcyCJ, mcyE, mcyEG, mcyHA, mcyTD elemek hiányát fedeztük fel. A mcyB nagy GC tartalmú gén nem tartalmaz az A, C, T doméneken kívül mást, viszont nagy átfedést mutat a mcyA génnel. Feltételezhető, hogy a mcyB kiesése a mcyA működésében zavart okozhat. A mcyG tiolizációs és adenilációs doméneken kívül ketoacil-szintáz, acil-transzferáz, ketoreduktáz, és ACP doméneket tartalmaz, mutáció esetén ezek sérülnek. A mcyD a klaszter legnagyobb génje. Csak PKS doméneket kódol, ezért hiánya során gátlódik a PKS és ebből kifolyólag a toxintermelés is. Feltűnő, hogy a nagy GC tartalmú mcyT minden gélen megjelent. Pontos funkciója még ismeretlen, viszont mivel ez a gén a mcy génklaszter kezdő szekvenciája, valószínűleg az átírásban lehet szerepe. Az eredményeink alapján a mcyT jó marker lehet Planktothrix fajok jelenlétének igazolására. Látható tehát, hogy akár egyetlen gén kiesése az adott toxin termeléséért felelős klaszterből mennyire befolyásolhatja a bioszintetikus folyamatokat. Mivel a toxin termelésében résztvevő domének szoros kapcsolatban állnak egymással, egy funkcionális fehérjerész inaktivitása negatív hatással lehet a többi működésére. Ez a jelenség nem egyedi a Planktothrix genusra nézve, a cianobaktériumokra általánosan jellemző. Egy cianobaktériumfaj különböző populációi eltérő mértékben lehetnek toxintermelők, illetve az is előfordulhat, hogy egy, ugyanazon fajba tartozó populáció egyáltalán nem termel toxint. Egy nagyobb toxicitású szervezet, még ha a nagyszámú, toxint nem termelő alfajok között kis számban is van jelen, okozhat jelentős mértékű toxikus vízvirágzást (Dittman és mtsai. 1997). Ez azt jelenti, hogy azok a minták, amelyek a toxintesztek során nem minősültek toxintermelőnek, igenis tartalmazhatnak toxintermelő egyedeket. A cianobakteriális tömegprodukciók természetesen vegyes genetikai állományú egyedekkel rendelkeznek, munkánk során az érdekelt minket, hogy egy ilyen vízvirágzás összességében mennyire toxintermelő, mennyire toxikus. 1. táblázat.. Detektált mcy-gének Planktothrix vízvirágzás mintákban. mcyA mcyB mcyCJ mcyE mcyEG mcyHA mcyT mcyTD MCY Szirmabesenyő, Kocka-tó + + + + + + + + McyRR Várpalota, Bivalyos-tó + + + + + + + + McyRR Gyula, Hősök-tava + + + + + + + n.d. Hajdúhadház, Sipos-tó + + + + + n.d. Kis-Balaton, 4T + n.d. A vizsgálatunk tárgyát képező Planktothrix fajok az Északifélgömb édesvizeiben általánosan előforduló szervezeteknek tekinthetők, Európában és Észak-Amerikában egyaránt idézhetnek elő vízvirágzást. Munkánk során, a hazai vízterekből két Planktothrix fajt, a Planktothrix agardhii-t és a Planktothrix rubescens-t sikerült azonosítani. A Planktothrix agardhii a mérsékelt övi eutrofikus vizek kedvelője, Magyarországon épp olyan általános a megjelenése, mint Európa más területein. Hazánk vizei kitűnően biztosítják a nyári-nyár eleji vízvirágzáshoz szükséges környezeti faktorokat, ugyanakkor toxintermelése nem általánosítható. A vizsgált mintáink között találtunk erősen toxikus állományt (várpalotai minta) és kevéssé toxikus megjelenési formát. A Planktothrix rubescens magyarországi megjelenése azonban figyelemreméltó, tekintve, hogy nem vagyunk alpesi ország, valódi rétegzett mély tavaink száma csekély. A vízvirágzások túlnyomó részét Magyarországon a prokarióta cianobaktériumok idézik elő elsősorban a nyári időszakban, intenzív zöldes, kékes, sárgás színnel. A 7-8 méteres mélységű Kockató felszínén megfigyelt novemberi vízvirágzás azonban szokatlan, vörös színű volt. Laboratóriumi vizsgálatok kimutatták, hogy a jelenséget P. rubescens okozta (Vasas és mtsai. 2009). A vörös színű cianobaktérium észak-magyarországi megjelenése azért szokatlan, mert a fajt eredetileg hidegvizi sztenoterm szervezetként tartják számon, amely Közép-Európa és Dél-Európa subalpin, alacsony hegyvidéki, mély tavaiban terjedt el. A Planktothrix szervezetek által előidézett vízvirágzásokból gyűjtött minták közül a Szirmabesenyői P. rubescens és a várpalotai Bivalyos-tóból gyűjtött minta volt erősen toxikus. A mintákból a mikrocisztin-RR, ciklikus peptidet sikerült kimutatnunk. Megvizsgáltuk a toxintermelésért felelős PKS/PS génklaszter elemeit és az említett két toxikus vízvirágzás esetében a mcy génklaszter leírt összes elemének jelenlétét igazoltuk. A mikrocisztint nem tartalmazó vízvirágzások esetében a klaszter néhány elemének jelenlétét igazoltuk. A mikrocisztin szintézist irányító génklaszter (MCY operon) néhány elemének jelenléte még nem igazolja a toxintermelést, a klaszter minden elemére tervezett primer jelenléte valószínűsíti a toxintermelést. A mikrocisztin szintézist irányító génklaszter (MCY operon) MCY-T elemére tervezett primer segítségével igazolhatjuk a Planktothrix sp. jelenlétét a vízmintában.