Hidrológiai Közlöny 2008 (88. évfolyam)

6. szám - IL. Hidrobiológus Napok: „A Balaton és vízrendszere – a Balaton-kutatás története” és „A Duna-kutatás története” Tihany, 2007. október 3–5.

133 A Harkány környéki termál karsztvizek baktériumközösségei Miseta Roland, Palatinszky Márton, Márialigeti Károly, Borsodi Andrea ELTE Mikrobiológiai Tanszék; 1117. Budapest, Pázmány Péter sétány 1/C Kivonat: A Harkány környéki karsztvizek baktériumközösségeinek összetételét molekuláris biológiai módszerekkel tanulmányoztuk. A Büdöstapolca langyos vizű, szulfidos kútjaiból származó vízmintákban mikroszkópos vizsgálatok során morfológiájukat tekintve Thiothrix jellegű, fonalas, kén-szemcséket tartalmazó baktériumok jelenlétét figyeltük meg. A vízminták szűréssel tömörített biomasszájából közösségi DNS-t vontunk ki. A 16S rRNS génjét univerzális bakteriális és Thiothrix-specifikas primerekkel PCR során felszaporítottuk, és klónkönyvtárakat hoztunk létre. A klónokat restrikciós enzimekkel emésztettük, és hasítási mintázatuk alapján csoportosítottuk. A csoportreprezentáns klónok szekvenálását követően a kapott szekvenciák filogenetikai hovatartozását a BLAST internetes adatbázis segítségével végeztük. A fonalas Thiothrix kénbaktériumok jelenlétét mindkét primer használatával igazoltuk, bár egyik esetben sem bizonyultak domináns közösségalkotóknak. Az univerzális klónkönyvtár fő közösségalkotói epszilon-proteobaktériumok, továbbá a Desulfocapsa, a Thiothrix és a Thiovirga nemzetségek képviselői voltak. A 77ii'o/ftrá-specifikus klónkönyvtár fo közösségalkotói a béta-proteobaktériumok, továbbá a Thiothrix unzii, Thiothrix fructosivorans, és egyéb Thiothrix sp. volt. Az azonosított klónokkal legnagyobb szekvencia-hasonlóságot mutató szervezetek obligát és fakultatív kemolitotróf anyagcseréjü kénbaktériumok, ezért feltételezhető, hogy a termálvízben élő szervezetek elsősorban a víz kémiai összetételét meghatározó szulfid-koncentráció szabályozásában játszhatnak szerepet, karsztvíz, kemolitotróf kénbaktériumok, klónkönyvtár, 16S rDNS szekvencia analízis Kulcsszavak: Bevezetés Harkány város Baranya megye déli részén a Dráva folyó völgyében fekszik. Északról a kelet-nyugati vonulatú, pikkelyes szerkezetű Villányi-hegység határolja, mely a földtörténeti középkorban keletkezett karbonátos kőzetekből épül fel. Déli irányban e pikkelyek több száz méter mélyre hatolnak, fiatal fedőüledékekkel fedettek. Csak néhány helyen (Harkány, Büdöstapolca, Matty, stb) közelítik meg a felszínt, illetve bukkannak a felszínre (Siklós, Kistapolca, Beremend). A méltán híres harkányi gyógyvíz vízbázisa a karsztosodott mészkőrétegekben tárolt meleg és langyos karsztvíz, melyet a harkányi melegvizű termálkutakból, valamint a langyos vizű mattyi és büdöstapolcai kutakból termelnek ki. A Harkánytól mintegy 5 km-re keletre fekvő ingoványos területen található a gyógyfürdő két langyos vizű kútja, melyek 70 méter mélyről, kalciterekkel átjárt, repedezett, üreges mészkőrétegből szolgáltatják a szulfidos karsztvizet. A karsztvíz bázis egész évben közel állandó kémiai összetételű és fizikai tulajdonságú vizet ad. A Büdöstapolca 1. sz. kút vize 17-20°C hőmérsékletű, szulfidtartalma 1,1-4,6 mg 1" . A Büdöstapolca 2. sz. kút vize 22-24°C-os, szulfidtartalma 4,2-7,8 mg l"

1. A két kútból származó vízmintákban fáziskontraszt mikroszkópos vizsgálattal rendszeresen előforduló, fonalas, kénszemcséket felhalmozó baktériumok jelenlétét figyeltük meg. A Thiothrix jellegű fonalak elágazás nélküliek, felületre tapadt, egy pontból kiinduló csomókba, kötegekbe tömörült aggregátumokat képeztek. A Thiothrix kénbaktériumok tipikus aerob kemolitotróf, szulfid-oxidáló baktériumok. Jelenlétük a szulfidos termálvizeken kívül gyakran megfigyelhető szennyvíztelepeken az eleveniszapos medencékben, tengeri üledékekben (Moissl és mtsai, 2002). Szénforrásként a vízben oldott C0

2-t és HC0

3 -t használják fel. A szén beépüléséhez szükséges energiát - szervetlen anyagoknak - elsősorban a vízben lévő oldott szulfidnak az oxidálásával nyerik. A szulfid oxidálása során vízben oldhatatlan elemi kén keletkezik, ami a baktériumsejtekben felhalmozódik. A kénszemcsék mérete, sejten belüli elhelyezkedése taxon-specifikus bélyegek, melyek eltérő fénytörőképességük révén fáziskontraszt mikroszkóppal vizsgálva a sejtfonalakban jól megfigyelhetők. A Thiothrix nemzetségen belül anyagcsere, és egyéb fenotípusos tulajdonságaik alapján a fajokat két csoportra különíthetjük el. A T. nivea csoport tagjai (T. fructosivorans, T. nivea, T. ramosa, T. unzii) nem, vagy csak csekély mértékben hasznosítanak cukrokat, míg a „02IN" csoport tagjai (T. defluvi, T. disciformis, T. eikelboomi, T. flexilis) képesek cukrot is hasznosítani. A T. nivea csoport tagjainak mindig szükségük van redukált kénvegyületek jelenlétére, baktériumfonalaik hossz mérete 1 mm alatt van, és a filamentumok köré hüvelyt képeznek. A „02IN" csoport tagjainál a baktériumhüvely hiányzik (Aruga és mtsai, 2002). Jelen munka során a büdöstapolcai szulfidos termálkarsztkutak vizének baktériumközösségeit tenyésztéstől független molekuláris biológiai módszerekkel tanulmányoztuk. Vizsgálati anyag és módszerek A büdöstapolcai kutakból 2006. novemberében vettünk vízmintát 5 literes fertőtlenített műanyag kannákba. A vízmintákat a mintavétel napján 0,45 jim pórus-átmérőjű membránfilteren szűrtük át. A biomasszát a filterekről centrifuga csövekbe mostuk, majd 3200 rpm-en 10 percig centrifugáltuk. A felülúszót elöntöttük, majd a végtérfogatot az üledék mennyiségének függvényében 1,5-2 ml-re állítottuk be. A két langyos vizű karszt-kútból azonos mennyiségű biomasszát öntöttük össze, így a továbbiakban kompozit mintával dolgoztunk. A biomasszából a fonalas kénbaktériumok jelenlétét fáziskontraszt mikroszkóppal vizsgáltuk 200-400-szoros nagyításon, majd a mintákat további felhasználásig -20°C-on tároltuk. A 16S rDNS bázissorrend elemzésre alapozott faji-szintű azonosításhoz a baktériumok DNS-ét MOBIO Ultra Clean Soil Kit segítségével nyertük ki. A 16S rDNS szakaszokat 27f: 5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3'és 1492r: 5' TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3' univerzális eubakteriális, valamint thio 22f: 5' AAT ACC GCA TAC GCC CTA CG 3', thio 399r: 5' CCT ACG CAC GCT TTA CGC CC 3' Thiothrix-speciíikus primerekkel PCR során felszaporítottuk. A PCR termékeket Viogene PCR-M Clean Up kit segítségével tisztítottuk meg. Az izolált és a felszaporított DNS jelenlétét UV fény alatt 1 %-os agaróz gélben detektáltuk. Univerzális és Thiothrix-specifikus klónozást végeztünk PROMEGA pGEM-T Easy Vector kittel. A vektor-specifikus primerekkel felszaporított inszerteket restrikciós enzimekkel (Hinól és BsuRI) emésztettük. A hasított termékeket UV fény alatt 2 %-os agaróz gélben detektáltuk, és ARDRA mintázatuk alapján csoportosítottuk. A reprezentáns klónok szekvenálását 519r: 5' ATT ACC GCG GCT GCT GG 3' primer felhasználásával a jelölt termináto-