Hidrológiai Közlöny 2007 (87. évfolyam)
6. szám - XLVIII. Hidrobiológus Napok: Európai elvárások és a hazai hidrobiológia Tihany, 2006. október 4–6.
58 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2007. 87. ÉVF. 6. SZ. Ultra tiszta vizek bakteriológiai vizsgálata tenyésztésen alapuló és tenyésztéstől független módszerekkel Bohus Veronika 1' 2, Székely Anna 1' 2, Makk Judit 1, Márialigeti Károly 1' 2, M. Tóth Erika 1 "Eötvös Loránd Tudományegyetem, Mikrobiológiai Tanszék, 1117. Budapest, Pázmány Péter sétány 1/C. 2ELTE Környezettudományi Kooperációs Kutató Központ, 1117. Budapest, Pázmány Péter sétány l/A. Kivonat: Az ultra tiszta vizek bár nagyon alacsony só- és tápanyag tartalmúak, mikrobiálisan szennyeződhetnek, a bennük élő mikrobák korróziós folyamatokat indukálhatnak. Vizsgálataink során egy ipari hűtővízrendszer mikróbaközösségeinek elemzését végeztük el. A csövek felszínén kialakult biofilm mintákat pásztázó elektron mikroszkópos (SEM) vizsgálatnak vetettük alá. A vízkészítésben alkalmazott ioncserélő gyanta táp- és elvezető csöveiből származó vízminták dúsítását és tenyésztését oligotróf tápközegekben végeztük. Random izolálást követően a baktériumokat zsírsav profiljuk alapján csoportosítottuk. A fenon reprezentánsokat és a nem csoportosuló törzseket 16S rDNS bázissorrend meghatározásnak vetettük alá. Ezzel egyidejűleg 14-14 liter vízminta szürletéből történő közvetlen DNS izolálás után T-RFLP elemzést végeztünk. A SEM vizsgálatok a biofilm mintákban változatos mikroba közösség jelenlétét mutatták, köztük a HyphomicrobiumoV.ru jellemző bimbódzó formákkal. A tenyésztéses vizsgálat alapján a vizekben az aerob, kemoorganotróf ß-proteobaktcriumok dominanciája volt jellemző. Mellettük a- és y-proteobaktériumok, valamint a Bacillus nemzetség képviselőit is sikerült detektálnunk. T-RFLP módszer segítségével is komplex mikrobiális közösséget találtunk, szintén ßproteobaktérium dominanciával. A két vízminta T-RFLP mintázata hasonlónak bizonyult, különbségek főleg a résztvevő szervezetek arányaiban voltak kimutathatók. A víz és a biofilm minták karakterisztikus különbségeket mutattak. Kulcsszavak: oligotróf víz, biofilm, baktérium, tenyésztés, szekvencia analízis, T-RFLP Bevezetés A nagy tisztaságú vizek csak nyomokban tartalmaznak szerves (l-15mg C/liter) és szervetlen molekulákat, elviekben mikroorganizmusoktól mentesek. Az ilyen kis ozmotikum és tápanyag tartalommal jellemezhető közegek a legtöbb élőlény számára különleges környezetet jelentenek, azonban mikroorganizmusok egy csoportja, az ún. oligotróf szervezetek az ilyen szélsőséges paraméterekkel rendelkező környezetekhez adaptáltak (Penna és mts., 2002). Sok iparágnak okoz gondot az általuk előállított és használt nagy tisztaságú víz mikrobiális szennyeződése, mivel a különböző vízzel érintkező felületek (tartályok, csőfelületek) ideális helyet nyújtanak a bakteriális adhéziónak (Kulakov és mts., 2002). Napjainkban végzett kutatások rámutattak, hogy a nagy tisztaságú vizek fő kolonizáló szervezetei a különböző proteobaktériumok, a biofilm alkotásában és enterotoxinok termelésében fő szerepet játszó Pseudomonas fajok dominanciájával. Megtalálhatók még ezen kívül Gram-pozitív baktériumok (pl. aktinobaktériumok), valamint élesztők, algák képviselői is a vízben, komplex mikrobiális közösségeket alkotva (Sarró és mts., 2005). Egy magyarországi ipari hűtővízrendszer vízköreiben korróziós jelenségeket tapasztaltak. A korrózió egyetlen magyarázatának a vízrendszerben, valamint a vízelőkészítőben feltételezhető mikrobaszaporodás és ennek következtében kialakuló biofilm bevonatok tekinthetők. Ultra tiszta vizek esetében ennek a feltételezésnek ellent mond a tápanyag-hiány. A tápanyagok feltételezett forrásaként a vízelőállításban alkalmazott ioncserélő műgyantákat, illetve a csőrendszerek belső gumibevonatát jelöltük meg. Jelen munkánk célja ezért a vízelőállító és a vízellátó rendszerek állapotának mikrobiológiai elemzése volt. Vizsgálati anyag és módszerek Mintavétel A kimerülő kevertágyas ioncserélő tápvezetékét és termékvezetékét megbontva a csővezeték belső terét (biofilmjét) vattatamponnal mintáztuk. Biofilm mintáink az alábbi helyekről származtak: 1.) befolyó (ioncserélő előtti) fekete gumibevonattal rendelkező cső biofilmje (BF), és barna gumibevonattal rendelkező cső biofilmje (BB); 2.) elfolyó (ioncserélő utáni) könyökcső fehér lepedékes gumi (barna) bevonata (EK), s a gyüjtőcső gumi (bama) bevonata (EG). Vízmintáink: tisztított víz, kimerülőben lévő gyantáról (R) és a tisztított víz, frissen indított, regenerált gyantáiról (Ú). Minták feldolgozása 1. Pásztázó elektronmikroszkópos vizsgálatok - SEM A biofilm mintáinkat (EK, BF) Makk és Ács (1996) liofilizálásos módszerét követve preparáltuk és a preparátumokat HITACHI S-2600N elektronmikroszkóppal elemeztük. 2. Tenyésztéses vizsgálatok 2.1. Tenyésztés, dúsítás, izolálás A vizekből közvetlen szélesztést, valamint dúsítást végeztünk 3 különböző táptalajon: TSA, M-27 (Stevenson és mts., 2004), R2A (Reasoner és Geldreich, 1985). A dúsítás során 2000 ml póttápvizet koncentrált táplevesekkel „dúsítva" inkubáltunk 2 napig 28°C-on. A vízmintákból ezután hígítási sort készítettünk, és a korábban említett táp-agarlemezekre szélesztést végeztünk. 5 napos 28°C-on történő inkubálást követően a lemezekről random módon baktériumtelepeket izoláltunk (66 Ú vízminta és 49 R vízminta izolátum), amelyeket tisztítottunk. Az első átoltások során néhány izolátum kipusztult, ezért a végül 65 Ú és 44 R baktérium törzzsel dolgoztunk. 2.2. Baktérium törzsek membránzsírsav elemzése (FAME) és a 16S rDNS gén részleges bázissorrend analízise Az eubaktériumok citoplazma membránjának taxonómiai értékű összetevői a zsírsavak, eltérő formában és arányban (szénlánc hossza, telítettségi foka, elágazás/gyűrű/hidroxil-/metil-csoport tartalma) vannak jelen a különböző mikrobiális csoportokban. Vizsgálatukkal lehetőség nyílik a baktériumok csoportosítására, hiszen a rokon taxonok hasonló zsírsav profillal jellemezhetők. A vizekből izolált 109 baktériumtörzs 24 órás ferde agar tenyészeteiből Embley és Wait (1994) módszerét követve membránzsírsavakat preparáltunk. A megfelelő illékony metilészterek kialakítása (volatilizálás) után a zsírsavakat gázkromatográffal elemeztük (HP1 kapilláris oszlop, HP5890, GC BAME standard). A kapott zsírsav összetételekkel Syntax 2000 programcsomag (Podani, 2001) segítségével csoportanalízist végeztünk (UPGMA, SM koefficiens), majd a csoport reprezentánsok és a csoportba nem sorolt törzsek 24 órás ferde agar tenyészeteiből V-Gene kit (BioRad) segítségével DNS-t izoláltunk. A baktériumok 16S rRNS génjét PCR segítségével elszaporítottuk (27F és 519R primerek). A PCR termék tisztítását PCR M™ Clean Up System kit (Viogene) segítségével végeztük. A szekvenáláshoz a Big Dye Terminator Sequencing Kitet (Applied Biosystems) alkalmaztuk (27F primer), majd mintáinkat automata genetikai analizátor (Applied Biosystems Model
