Hidrológiai Közlöny 2005 (85. évfolyam)

6. szám - XLVI. Hidrobiológus Napok: Szélsőséges körülmények hatása vizeink élővilágára, Magyarországi kisvízfolyások ökológiai viszonyai Tihany, 2004. október 6–8.

23 Tenyésztésen alapuló és tenyésztéstől független molekuláris biológiai vizsgálatok a Kiskunsági NP szikes tavainak baktériumközösségein Borsodi Andrea, Vladár Péter, Rusznyák Anna, Szabó Gitta, Sipos Rita, Márialigeti Károly ELTE Mikrobiológiai Tanszék; 1117. Budapest, Pázmány Péter sétány 1/C. Kivonat: A Kiskunsági Nemzeti Park (KNP) területén fekvő ,.székek" tipikus alkalikus, sósvizű, időszakosan kiszáradó, rendkívül sekély vizű szikes tavak. E tavak közül bakteriológiai vizsgálatok céljából a 2002-ben és 2003-ban a Kelemen-szék, a Zab-szék és a Böddi-szék területéről gyűjtött felszín közeli üledékmintákat dolgoztuk fel. A mikróbaközösségek fajgazdagságát a Kelemen-székből származó minták esetében tenyésztésen alapuló és tenyésztéstől független molekuláris biológiai diverzitás elemző módszerekkel is vizsgáltuk. Az izolált baktériumtörzsek és a DNS alapú 16S rDNS klónkönyvtár szekvencia analízisének eredményei nagyfokú eltérést mutattak, egyezés csak a gamma proteobaktériumok faji összetételében mutatkozott. A három tó esetében a baktériumközösségek diverzitásában a szezonális és ezzel összefüggésben álló környezeti hatásokra bekövetkező változásokat Denaturáló Gradiens Gél Elektroforézis (DGGE) módszer alkalmazásával követtük nyomon. A baktériumközösségek összetételében a tenyésztésen alapuló és a tenyésztéstől független DGGE vizsgálatok eredményeként sem lehetett szezonális különbségeket felfedezni, ami arra utal, hogy e szikes tavak feltehetően a speciális környezeti feltételekhez adaptálódott stabil mikróba populációkkal jellemezhetők, melyekben a szezonális változások sokkal inkább a közösségek aktivitását semmint az összetételét befolyásolják. Kulcsszavak: Kiskunsági Nemzeti Park, bakteriális biodiverzitás, 16S rDNS klónkönyvtár szekvencia analízise, DGGE, ARDRA. Bevezetés rDNS fragmentumok szelektív felszaporítása 27f és 1492r A természetes vízi ökoszisztémák, különösen az ún. ext- univerzális eubakteriális primer pár segítségével történt Birém környezetek mikróbaközösségei faji diverzitásának fel- ometra T PCR (Polimerase Chain Reaction) készülékben a tárására irányuló tenyésztésen alapuló vizsgálatok - mindenekelőtt a jelenleg rendelkezésre álló tenyésztési feltételek és módszerek korlátozott volta miatt - rendkívüli mértékben alábecsülik a természetben megfigyelhető sokféleséget. Egyes becslések szerint a mintákból ily módon lemezeléssel becsülhető csíraszám értékek mindössze 0,001-1 %-át teszik ki a mikroszkóposán megfigyelhető sejtszámoknak, ezért a mikrobiális ökológiai diverzitás vizsgálatokban is egyre szélesebb körben alkalmazzák a tenyésztéstől független molekuláris biológiai vizsgáló módszereket (

Spring és mts, 2000). A szélsőséges vízjárású, zavaros vizű, alkalikus kémhatású, meszes-sós kiskunsági „székek" baktériumközösségeinek megismerését célzó korábban megkezdett tenyésztésen alapuló vizsgálatainkat (Szabó és mtsai, 2004) jelen munkánkban a 16S riboszómális gének szelektív amplifikációján alapuló közösségi PCR termékek, tenyésztéstől független vizsgálatával (klónkönyvtár létrehozásával és egy molekuláris ujjlenyomat módszer, a DGGE alkalmazásával) tetOtük teljesebbé. Vizsgálati anyag és módszerek A KNP szikes tavainak (Kelemen-szék, Zab-szék és Böddi-szék) 2002. április 23-án és július 8-án, illetve 2003. május 8-án és október 29-én gyűjtött üledékfelszíni mintáiból végeztük mikrobiológiai diverzitás vizsgálatainkat. A Kelemen-székből származó mintákból hígítási sorozatot készítettünk, és annak különböző tagjaiból Horikoshi-féle alkalofil (Horikoshi, 1991), DSMZ Medium 1 és DSMZ Medium 246 (www.dsmz.de) táptalajokra szélesztettünk, majd a különálló telepeket random módon a lemezekkel azonos összetételű ferde agarra izoláltuk. A baktériumtörzsek fenotípusos tulajdonságait a standard mikrobiológiai leírásoknak megfelelően hagyományos tesztsorozatok segítségével vizsgáltuk (Borsodi és mtsai, 2001). A nagyfokú fenotípusos hasonlóságot mutató törzsek közül választott reprezentánsokat faji szinten azonosítottuk. A KNP szikes tavainak 500-500 mg-nyi üledékmintáiból a teljes genomi DNS kinyerését FAST DNA kit for Soil (BIO 101 Inc. USA) felhasználásával végeztük, majd a DNS huminanyagoktól, illetve egyéb szennyezőanyagoktól való tisztítását Geneclean Spin kit (BIO 101 Inc. USA) alkalmazásával a gyártó utasításait követve folytattuk. A 16S következő hőprofil mellett: kezdeti denaturáció 98°C 5 min, majd 32 cikluson keresztül denaturáció 94°C 30 s, anelláció 52°C 30 s és extenzió 72°C Imin, majd a végső extenzió 72°C 10 min. A kiindulási minta fajösszetételét tükröző vegyes 16S rDNS meglétét UV fény alatt 1%-os agaróz gélben detektáltuk. A faji diverzitás meghatározásához szükséges molekuláris klónok előállításához a TOPO TA Cloning® kitet (Invitrogen) választottuk, aminek a vektora lacZa-gén, illetve ampicillin és kanamicin rezisztencia alapján szelektív. A klónozás előkészítése során Petri-csészékbe 50 |ig ml"

1 végkoncentrációban ampicillin tartalmú LB-médiumot öntöttünk, és a táptalajok felületére 20 |il X-gal (80 mg ml"') oldatot szélesztettünk. A klónozás eredményeképpen csak a rezisztenciagént tartalmazó kiónozó vektorral transzformált sejtek nőttek ki a táptalaj felületén, melyek közül az idegen DNS-t felvettek p-galaktozidáz aktivitás hiányában fehér színű telepeket képeztek. A klónozás során egy gazdasejtbe kevés kivételtől eltekintve csak egy vektor kerül, így a kifejlődő telepek egy-egy amplifikált 16S rDNS, vagyis egy-egy baktériumfaj képviselőinek tekinthetők, melyek alkalmasak klónkönyvtár létrehozására. A klónok DNS-éből az inszertet M13f és M13r, majd 27f és 1492r primer párok segítségével polimeráz láncreakcióban (kezdeti denaturáció 96°C 4 min, 32 cikluson át denaturáció 95°C 30 s, anelláció 52°C 30 s, extenzió 72°C 1 min, majd végső extenzió 72°C 10 min) felszaporítottuk. A közel azonos méretű klónokat restrikciós endonukleázokkal (Alul és Hin6I) kialakított hasítási mintázatuk (ARDRA, Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) alapján csoportosítottuk. A Denaturáló Gradiens Gél Elektroforézisen (DGGE) alapuló mikrobiális diverzitás vizsgálatokhoz, melynek elvi alapjairól egy korábbi munkánkban már beszámoltunk (Rusznyák és mtsai, 2003), a 27f és 1492r univerzális eubakteriális primer párral nyert közösségi 16S rDNS amplikonokat egy második, ún. nested touch-down PCR során GC-kapcsos 968f és 140Ír primerekkel szaporítottuk fel (hőprofil: kezdeti denaturáció 96°C 3 min, 10 ciklusban denaturáció 94°C 30s, anelláció 62°C-ról ciklusonként 1°Ckal csökkenő hőmérsékleten, extenzió 72°C 40 s, majd további 20 ciklusban anelláció 52°C-on, és végül extenzió