Hidrológiai Közlöny 1991 (71. évfolyam)
4. szám - Martin Andrea M.: A Széchenyi fürdő II. számú termálkútjának autockton hévízi Bacillus-populációja
220 HIDROLOGIAI KÖZLÖNY 1991. 71. ÉVF. 4. SZÁM jókat használtuk: forrásvízből készült vizes agar; 0,2% glükóz és 0,017% NaN0 3 tartalmú vizes agar; élesztőkivonat-keményítő és húskivonatpepton (nutrient) tápagar. 1. módszer: A vízmintákból, hígítás nélkül 0,1 ml-nyi mennyiségeket Petri-csészékben lévő, a fent leírt négyféle tápagarra szélesztettünk. 2. módszer: A termálvíz 0,5—1,5 1 mennyiségeit 0,45 /ím pórusátmérőjű membránszűrőn szűrtük át, és a különböző tápagarlemezeken a szűrőlapon visszamaradt csírákat inkubáltuk. 3. módszer: A mikroaerofilek és az anaerobok számának becslésére tápagaroszlopokat Burricsövekben termálvízzel inokuláltunk. 4. módszer: Végül megkíséreltük a termálvízben élő baktériumokat dúsítani. E célból a vízmintákat különböző összetételű steril táplevessel (0,2% glükóz és 0,017% NaN0 3 tartalmú forrásvízből készített tápleves; húskivonat-pepton tartalmú és élesztőkivonat-keményítő tartalmú tápleves) elegyítettük, majd 2 hetes inkubációs idő elteltével a már ismertetett négyféle tápagarlemezekre szélesztettünk. A választott tenyésztési hőmérsékletek a különböző módszerek esetében eltérőek, 60 és 76 °C közöttiek voltak. Az élesztő kivonat-keményítő táptalaj különben mind a kitenyésztésekhez, mind a törzsek fenntartásához egyaránt a legmegfelelőbbnek bizonyult. A négy mintavétel során a leghatékonyabb izolálási eljások szelekciója céljából különböző kitenyésztési módszerekkel kísérleteztünk és é munkát jelenleg is folytatjuk. A tiszta tenyészetek előállítása élesztőkivonatkeményítő agaron újraterítéssel és reizolálással történt. A homogenitást telep-makromorfológiai, majd mikroszkópos megfigyelésekkel ellenőriztük. A fenntartás folyamatos havonkénti továbboltással élesztőkivonat-keményítő tápagaron történt, 65 °C-on 18 óráig inkubálva, majd a kifejlődés után tárolás szobahőmérsékleten. A tesztekhez külön tenyészvonalakat létesítettünk. A csoportosítást konvencionális szempontok szerint végeztük, és a biztonságosan, gyorsan leírható kulturális-morfológiai bélyegek alapján már kezdetben megállapítottuk, hogy törzseinket egyetlen csoportba tartozónak tekinthetjük. Diagnosztikai bélyegek: 1. Gram-reakció, 24 órás tenyészetekkel színtelenítés 96%-os alkohollal, differenciálfestós 1%-os szafranin oldattal. 2. Telepmorfológiai ós kulturális tulajdonságok sztereomikroszkóppal (telepszín-, típus-, szegély-, eleváció-, konzisztencia-, felület); sejtmorfológiai tulajdonságok fénymikroszkóppal (elrendeződés, alak ós méret) a Grarnfestés keneteiből. 3. Spórák kimutatása: 5 napos tenyészetek keneteit 6%-os malachitzölddel gőzölve, majd 1%-os szafraninnal ellenfestve. 4. Aktív mozgásra natív lefedett preparátumokat vizsgáltunk olajimmerziót alkalmazva fónymikroszkópos nagyítással. 5. Kataláz. 24 órás élesztőkivonat-kemónyítő-agar tenyészetek kezelése 10%-os H 20 2-dal. 6. Oxidáz. Élesztőkivonat-keményítő táplemezeken növekedő 24 órás tenyészetek kezelése p-aminodimethylanilin-monohidroklorid 1%-os vizes oldatával. 7. Glükóz oxidatív és fermentatív hasznosítása (O-F-teszt), Hugh és Leifson (1957) módszerével. Alaptáptalaj: pepton 2,0 g; NaCl 5,0 g; K 2HP0 4 0,3 g; agar (Oxoid) 3,0 g; deszt. víz 1000 ml; 0,2%-os brómtimolkók 15 ml; pH 7,0. A C-forrást (glükóz) Seitz-EK szűrőn át sterileztük. Beoltás szúrással, inkubálás 3 napig. 8. Növekedés anaerob agarban. Difco Bacto anaerob magas agar, szúrással inokulálva ós 3 napig inkubálva. 9. Citrátliasznosítás. Difco Simmon's citrate ferdeagaron. 10. Szerves sav (propionsav) hasznosítása egyedüli Cforrásként. Alapközeg módosított Koser-agar: Na( I 1,0 g; MgSG 4 -7H»0 0,2 g; (NH 4) 2HP0 4 0,5 g; agar (Oxoid) 15,0 g; deszt. víz 1000 ml; 0,04% fenol vörös oldat 20 ml; pH 6,8. Szerves sav sója (propionát) 0,2%-ban. A ferdeagar-tenyészeteket 3 napig inkubáltuk. 11. Kazein-hidrolízis. Bacto Skim Milk-el (2,5%) előállított nutrient-agar-lemezeken. A kazeáz-aktivitás ellenőrzése savas HgCl 2 oldattal 2 nap elteltével. 12. Zsclatináz. Zselatin-agar (zselatin 4,0 g; húskivonat 3,0 g; pepton 5,0 g; agar (Oxoid) 15,0 g; deszt. víz 1000 ml; pH 7,0) lemezeken; ellenőrzés savas HgCl 2-dal 3 napi inkubáció után. 13. Növekedés nutrient levestenyészetekben pH 5,7-nél ós pH 6,8-nál, 3 napos inkubáció során. 14. NaCl-tolerancia. Élesztőkivonatkeményítő táplevesben 3, 5, 7 és 9%-nyi NaCl jelenlétében 2 napi tenyésztés. 15. H 2S-termelós. a) Difco Pepton Iron agarban szúrással inokulálva, 5 na]) inkubáció. b) Nutrient-lovesben (NaCl 5,0 g; húskivonat 5,0 g; pepton 10,0 g; deszt. víz 1000 ml; pH 7,0), a kémcsőben a tenyészetek fölé ólomacetáttal impregnált szűrőpapírcsíkokat helyeztünk. 3 nap inkubáció után a papír feketedését vizsgáltuk. 16. Indolkópzés. Inkubálás peptonvízben (NaCl 5,0 g; pepton 10,0 g; deszt. víz 1000 ml; pH 7,0) 2 napig, detektálás Kovács-reagenssel. 17. NH 3-képzés peptonból. Tenyésztés peptonvízben (lásd előbb) 2 napig. A termelődött NH 3-át Nessler-reagenssel mutattuk ki. 18. Metilvörös és Voges-Proskauer-reakciók. Difco MR-VP közegben (pepton 7,0 g; glükóz 5,0 g; K 2IIP0 4 5,0 g; deszt. víz 1000 ml; pH 6,9) 2 napos inkubáció. Az acetoin detektálása Barrit-reagenssel. 19. Nitrátredukció. Az inokulált nitráttartalmú táplevesben (húskivonat 3,o g; pepton 10,0 g; KNO a 1,0 g; deszt. víz 1000 ml; pH 7,2) 3 napos inkubáció elteltével nitritre (Griess-llosvayreagenssel) ós az el nem bontott nitrátra (cinkporral) vizsgáltunk. 20. Fenilalanin dezaminálás. Alapközeg: DL-fenilalanin 1,0 g; ólesztőkivonat 3,0 g; Na 2HP0 4 1,0 g; NaCl 5,0 g; agar (Oxoid) 15,0 g; deszt. víz 1000 ml; pH 7,2. A ferdeagar tenyészeteket 3 nap után 10%-os FeCl a-dal kezeltük. 21. Keményítő-hidrolízis. Keményítő tartalmú agarlemezeken (Reanal vízoldható) keményítő 10,0 g; pepton 5,0 g; húskivonat 5,0 g; NaCl 5,0 g; agar (Oxoid) 15,0 g; deszt. víz 1000 ml; pH 7,0) kifejlődött kultúrákat 2 nap inkubáció után Lugol-ol<lattal kezeltük. 22. A növekedés hőmérsékleti intervalluma. Ferde N 2-jelzésű tápagaron (ólesztőkivonat 5,0 g; pepton 5,0 g; glükóz 10,0 g; szálas agar 25,0 g; doszt, víz 1000 ml; pH 7,0), 40°, 50° ós 60 °C-on 3 napos, ós 65°, 70°, 76° és 80 °C-on 1 napos inkubáció. 23. Ureáz aktivitás. Christensen-ferdetáptalajon (pepton 1,0 g; glükóz 1,0 g; NaCl 5,0 g; KH 2P0 4 2,0 g; agar (Oxoid) 15,0 g; 2%-os fenolvörös indikátor 6 ml, deszt. víz 1000 ml; pH 6,8; Seitz-EK-szűrőn átszűrt 20%-os urea oldat 10%-nyi mennyiségben) 2 napos inkubálás. 24. Tween hidrolízis. Tween—20, —40, —60 ill. —80 egy %-nyi koncentrációban pepton-agarban (pepton 10,0 g; NaCl 5,0 g; CaCl., -2H tO 0,1 g; agar (Oxoid) 15,0 g; deszt. víz 1000 ml; pH 7,0—7,4). Az inokulált lemezek inkubálása 2 napig. 25. Metilénkél redukció. A tápleves (tripton 5,0 g; húskivonat 3,0 g; 0,1%-os metilónkék 6,6 ml; deszt. víz 1000 ml; pH 7,0) elszíntelenedését vizsgáltuk n beoltatlan kontrollhoz képest 2 napi inkubáció után. 26. C-forrás értékesítés. Vizsgálat szervetlen N-forrást tartalmazó alaptáptalajon. Alapközeg: NaCl 1,0 g; MgS0 4 0,2 g; (NH 4)„ -HP0 4 1,0 g; KH 2P0 4 5,0 g; agar (Oxoid) 15,0 g; 0,04%os fenol vörös indikátor 20 ml (savképzós detektálására); deszt. víz 1000 ml; pH 6,8—7,0. A Seitz-EK-szfírőn át sterilezett C-forrás (glükóz, arabinóz, dextrin, laktóz, mozit, szaharóz, mannit, xilóz) 0,5%-ban. Összehasonlítás a tenyésztés 3., ill. 5. napjain a C-forrást nem tartalmazó negatív kontrollal.
