Fogorvosi szemle, 2018 (111. évfolyam, 1-4. szám)
2018-06-01 / 2. szám
39 FOGORVOSI SZEMLE ■ 111. évf. 2. sz. 2018. Vizsgálati anyag és módszer Fogbél eredetű őssejtek izolálása, és tenyésztése A fogbél eredetű őssejtek izolálását, illetve a sejteken végzett kísérleteket az ETT TUKEB 49849-3/2016/EKU ügyiratszámú engedély birtokában végeztük el. A fogbél eredetű őssejtek izolálásához a Debreceni Egyetem Fogorvostudományi karán ellátott páciensekből sebészi úton eltávolított, sértetlen bölcsességfogakat használtuk. A fogakat 10% totális marhaszérumot (FBS) (Gibco, Waltham, MA, Egyesült Államok), 1% Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin B) oldatot (Gibco, Waltham, MA, Egyesült Államok) és 1% Glutamax (Gibco, Waltham, MA, Egyesült Államok) kiegészítést tartalmazó DMEM F12 (Gibco, Waltham, MA, Egyesült Államok) tenyésztő médiumba helyeztük. A fogak szeparálása és kettérepesztése után a pulpát eltávolítójuk, steril szikével feldaraboltuk, majd egy órán át emésztettük 37 C°-on, 3 mg/ml kollagenáz (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Egyesült Államok) és 4 mg/ml diszpáz (Gibco, Waltham, MA, Egyesült Államok) enzimet tartalmazó tenyésztő médiumban. A mintákat emésztés közben 15 percenként vortexeltük, majd az inkubáció után centrifugáltuk 5 percig 1200 RPM-en. A lecentrifugált sejtekről a felülúszót eltávolítójuk, a sejteket tenyésztő médiumban szuszpendáltuk, majd 6 lyukú sejttenyésztő lemez egyik lyukába ültettük ki. Az izolált sejteket 37 C°-on 5% C02 tartalom mellett tenyésztettük nagyobb tenyésztő edénybe történő áthelyezésükig. A tenyésztő médiumot kétnaponta cseréltük. A sejteket a harmadik passzálás után használtuk fel a transzdukcióhoz. A BMP-7 gén klónozása A BMP-7 fehérjét kódoló, a széleken BamHI hasítóhelyet tartalmazó génszakaszt (Genscript, Piscataway, NJ, Egyesült Államok) T4 ligáz enzim (New England Biolabs, Ipswich, MA, Egyesült Államok) segítségével illesztettük be a pTet-IRES-EGFP plazmid [23] (Addgene plasmid # 64238) BamHI klónozó helyére. A pTet-IRESEGFP plazmid Maria Lung (University of Hong Kong, Department of Clinical Oncology) ajándéka. Az elkészült pTet-IRES-BMP7 plazmidot Stbl3 kompetens E. coli sejtekbe (Invitrogen, Carlsbad, CA, Egyesült Államok) transzformáltuk, amelyet aztán 100 mg/ml ampicillint tartalmazó agarózra szélesztettünk és növesztettük fel. A kinőtt telepekből éjszakai kultúrát indítottunk, amelyből azután plazmidot preparáltunk Monarch Plasmid Miniprep Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, Egyesült Államok) segítségével, majd 5’-AGAGCTCGTTTAGTGAACCG-3’, 5’-AACGCACACCGGCCTTATTC-3’ és 5’-CTACCACCATCGAGAGTTCC -3’ oligonukleotidok alkalmazásával szekvenáltuk annak igazolására, hogy a plazmidunk helyes orientációban tartalmazza a kívánt BMP-7 fehérjét kódoló génszakaszt. A DNS szekvenálást ABI Prism Dye terminator cycle sequencing kit és 3100-Avant Genetic Analyzer (mindkettő Applied Biosystems, Foster City, CA, Egyesült Államok) készülék használatával végeztük. Lentivírus-termelés és transzdukció A vírusrészecskék előállításához humán embrionális vesesejtekből származó Lenti-X 293T sejteket (Clontech Laboratories, Mountain View, CA, Egyesült Államok) használtunk, amelyeket 10% FBS, 1% antibiotic/ antimycotic (Gibco, Waltham, MA, Egyesült Államok) és 1% Glutamax (Gibco, Waltham, MA, Egyesült Államok) kiegészítést tartalmazó Dulbecco’s modified Eagle’s (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA, Egyesült Államok) médiumban tartottunk fent. A sejteket polietilénimin (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Egyesült Államok) segítségével transzfektáltuk. A sejteket addig növesztettük, míg megközelítőleg 70%-ban borították be a 75 cm2-es tenyésztőflaska alját és ekkor végeztük el a transzfekciót. A lentivirális pTet-IRESEGFP, pTet-IRES-BMP7 vagy pLenti CMV rtTA3 blast plazmidokat, a psPAX2 (Addgene plasmid 12260) csomagoló plazmidot és a pMD2.g (Addgene plasmid 12259) envelop plazmidot 4:3:1 arányban összekevertük. A transzfekciót 1% FBS tartalmú DMEM médiumban hajtottuk végre, amit 6 óra elteltével 10% FBS tartalmú médiumra cseréltünk. A sejteket a transzfekció után 3 napig tartottuk a tenyésztő médium cseréje nélkül. A vírusrészecskéket tartalmazó kondicionált médiumot centrifugáltuk azért, hogy eltávolítsuk a sejttörmeléket, majd 0,45 pm pórusméretű PVDF fecskendőszűrőn (Merck Millipore, Billerica, MA, Egyesült Államok) átszűrtük és szétporciózva -70 °C-on tároltuk. A sejtek 6 lyukú sej jenyésztő lemezen történő transzdukciójához 6 lyukú sejttenyésztő lemezre lyukanként 105 darab fogbél eredetű őssejtet ültettünk ki. A következő napon 500 pl pLenti CMV rtTA3 Blast vírusrészecskét, 500 pl pTet-IRES-EGFP (mock kontroll) vagy pTet-IRES-BMP7 vírusrészecskét és 1 ml üres DMEM F12 médiumot 8 pg/ml végső koncentrációjú polibrénnel (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Egyesült Államok) kevertünk össze, a sejtekre mértük és 16 órán keresztül inkubáltuk. Ezután a transzfekciós elegyet friss tenyésztő médiumra cseréltük. Az első passzálás után a sejteket 5 napig a médiumhoz adott 4 pg/ml koncentrációjú blaszticidinnel (Gibco, Waltham, MA, Egyesült Államok) kezeltük, hogy eltávolítsuk a pLenti CMV rtTA3 Blast vírusrészecskékkel nem transzdukált sejteket. Az antibiotikumos szelekció után a tenyésztő médiumhoz adott doxycyclinnel (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Egyesült Államok) indukáltuk a sejtek zöld fluoreszcens fehérje (GFP) és BMP-7 termelését, majd a sejteket fluoreszcens mikroszkóppal (Zeiss Axiovert 100, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Németország) és áramlási citometriával (BD FACSCalibur, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EgyesültÁllamok) vizsgáltuk azért, hogy megállapítsuk a transzdukció hatékonyságát.
