Fogorvosi szemle, 2018 (111. évfolyam, 1-4. szám)
2018-06-01 / 2. szám
40 FOGORVOSI SZEMLE ■ 111. évf. 2. sz. 2018. Génexpresszió vizsgálata 4 X 101 * * 4 sejtet ültettünk ki 24 lyukú sejttenyésztő lemez megfelelő számú lyukába. A következő napon a sejtekből mintát vettünk, majd a tenyésztő médiumot lecseréltük friss, megfelelő összetételű médiumokra (tenyésztő vagy differenciáló) 100 ng/ml doxycyclin hozzáadásával, vagy anélkül. Az 1., 4. és 7. napokon a sejtekből újabb mintát vettünk és mRNS-t vontunk ki Quick-RNA Miniprep kit segítségével (Zymo Research, Irvine, CA, Egyesült Államok) a gyártó utasításai szerint. Mintánként 200 ng mRNS került átírásra High Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, Egyesült Államok) alkalmazásával. Az elkészült cDNS mintákon kvantitatív PCR analízist végeztünk LightCycIer 480 (Hoffmann- La Roche, Bázel, Svájc) készülék segítségével, HOT Firepol Probe qPCR mix (Solis BioDyne, Tartu, Észtország) és génspecifikus TaqMan reagensek használatával. A mérési eredményeket glicerinaldehid-3-foszfátdehidrogenáz (GAPDH) háztartási gén expressziójára normalizáltuk. A kísérleteket időpontonként három párhuzamos mintával végeztük, a qPCR vizsgálatban egy minta három technikai ismétléssel került lemérésre. BMP-7 immunoblott 2 X 105 sejtet ültettünk ki 53 mm átmérőjű sejttenyésztő petricsészékbe. A következő napon a sejteken a tenyésztő médiumot friss médiumra cseréltük 3,125; 6,25; 12,5; 25; 50; 100 illetve 200 ng/ml doxycyclin hozzáadásával, vagy anélkül. A sejteken kétnaponta médiumot cseréltünk, a 6. napon 10 pg/ml Brefeldin A (Tocris Bioscience, Bristol, Egyesült Királyság) hoz_ 70 S*. §. 60 c-<Q « 50-X V ÏT 40 ? 30 E S 20 Cl $ 10 ■ No dox ■ 3,125 ng/ml ■ 6,25 ng/ml ■ 12,5 ng/ml ■ 25 ng/ml ■ 50 ng/ml ■ 100 ng/m I ■ 200 ng/m I 1. kép: Dózisfüggő GFP expresszió DPSC sejtekben. Az egy páciensből származó DPSC sejteket pLenti CMV rtTA3 blast és pTet-IRES-BMP7 plazmidot tartalmazó vírusrészecskékkel transzdukáltuk, majd blaszticidines szelekció után különböző koncentrációjú doxycyclinnel voltak kezelve (3,125; 6,25; 12,5; 25; 50; 100 és 200 ng/ml). (A) Reprezentatív mikroszkópos felvételek a különböző koncentrációjú doxycyclinnel kezelt DPSC-BMP7 sejtekről. (B) GFP termelő sejtek százalékos arányának meghatározása áramlási citometriával. záadásával gátoltuk az endoplazmatikus retikulumból a golgi-készülékbe történő fehérjeszállítást. A 7. napon a sejteket radioimmuno-precipitation assay puffer (150 mM NaCI; 1% Triton X-100; 0,5% nátrium deoxycholate; 0,1% SDS; 50 mM Tris-HCI és 1% proteáz inhibitor koktél; pH 8) segítségével lizáltuk. A sejtlizátumok fehérjekoncentrációját BCA protein assay kit segítségével határoztuk meg. Mintánként 20pg fehérjét választottunk el 10%-os TGX Stain-FreeTM FastCastTM akrilamid gélen (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, Egyesült Államok), majd az elválasztott fehérjéket polivinil-fluorid (PVDF) membránra (Bio-Rad Laboratories) blottoltuk át. A membránokat 5% tejport tartalmazó Tris Buffered Saline with Tween 20 pufferrel (TBST) blokkoltuk, majd 400x-os higítású BMP-7 (Santa Cruz Biotechnologies, Dallas, TX, Egyesült Államok), illetve 5000x-es higítású GAPDH (LifeSpan Biosciences, Seattle, WA, Egyesült Államok) elleni antitesttekkel inkubáltuk egy éjszakán át. A mosási lépések után 2000x-es higítású anti-mouse HRP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Egyesült Államok) másodlagos antitesttel inkubáltuk 1 óráig szobahőmérsékleten és az immunoblottokat BMP-7 esetében SuperSignal® West Femto Maximum Sensitivity Substrate, a GAPDH esetében pedig SuperSignal® West Pico Chemiluminescent Substrate használatával hívtuk elő a gyártó utasításai szerint. Az eredményeket ChemiDocTM Touch Imaging System (Bio-Rad Laboratories) segítségével detektáltuk. Eredmények A transzdukált sejtek GFP expressziója doxyciklin dózisfüggést mutat A pLenti CMV rtTA3 blast és pTet-IRES-BMP7 plazmidot tartalmazó vírusrészecskékkel transzdukáltunk DPSC sejteket, majd az antibiotikumos szelekció után 3,125 ng/ml-től 200 ng/ml-es doxycyclin koncentrációig terjedő tartományban vizsgáltuk a sejtek GFP termelését fluoreszcens mikroszkópia és áramlási citometria alkalmazásával. Ahogy az 1. képen is megfigyelhető, a DPSC-BMP7 sejtek GFP expressziója dózisfüggést mutat. A doxycyclinkoncentráció és a GFP jel kapcsolata szigmoid görbével írható le. A bazálisan GFP-t termelő sejtek száma nagyon alacsony, nem éri el az 1%-ot, a doxycyclinkoncenmennyiség növelésével együtt növekszik, 200 ng/ml-es doxycyclinkoncentrációnál már a sejtek 70%-a termel GFP-t. A koncentráció további növelése már nem okoz számottevő változást. A BMP-7 mRNS szintje jelentős növekedést mutat az indukált DPSC-BMP7 sejtekben A BMP-7 transzgén expresszió működésének, illetve a bazális transzgénexpresszió szintjének vizsgálatához a sejteket tenyésztő médiumban növesztettük 100 ng/ ml doxycyclin hozzáadásával, vagy anélkül. 1., 4. és
