Fogorvosi szemle, 2016 (109. évfolyam, 1-4. szám)
2016-09-01 / 3. szám
76 FOGORVOSI SZEMLE ■ 109. évf. 3. sz. 2016. majd az így kialakult allergént (haptén és fehérje komplex) az antigént prezentáló Langerhans-sejtek eljuttatják a nyirokcsomóba, és az itt lévő T-limfociták antigénspecifikus memóriasejtekké alakulnak át. Az említett konjugációs kölcsönhatásokban, a kötőfelszínek kialakításában aminosav kombinációk sokasága vehet részt. A fehérje kölcsönhatások vizsgálhatók, pl. irányított evolúciós technikával. A leggyakoribb irányított evolúciós technika a fág bemutatás (phage display) [3, 15, 19]. Fág bemutatásos technikára többféle bakteriofág alkalmazható. A bakteriofágok baktériumot fertőző vírusok. A fág bemutatásos technika során leggyakrabban használt bakteriofág a fonalas M13 fág [23]. Előnyük, hogy egyszerűen kezelhetők, a fenotípus és a genotípus közötti fizikai kapcsolat könnyen biztosítható, F-pilussal rendelkező baktériumokat fertőznek meg, így ezekben könnyen szaporíthatok [17]. Ezen egyszerű szervezetek egyszálú DNS láncában egy ismert szekvenciájú, kombinatorikus módszerrel előállított heptamer vagy dodekamer peptidet kódoló szakasz található. Ugyanazon peptid szekvencia a fág burokfehérjéjéhez is fuzionálva van, így a fág adott felületre való ráhelyezésekor ezen peptidek kerülnek bemutatásra, amelyek affinitásuknak megfelelően erősebben vagy gyengébben kötődnek. A kötődött fágok amplifikálására, a fág Escherichia coli gazdasejtben szaporítható. Ahhoz, hogy különbséget tegyünk az idegen DNS-t tartalmazó és nem tartalmazó plazmidok között, a színtelen X-gal molekulát alkalmaztuk. A coli gazdasejt tággal történt fertőzés hatására enzim (béta galaktozidáz) termelődik, ami az X-gal molekula szubsztráttal kék színű terméket produkál. A bakteriofággal történt fertőzés hatására termelődő enzim jelenléte vagy hiánya egyszerűen, érzékenyen kimutatható, valamint egy kék színű plakk egyértelműen egy kiónt jelöl a telepen. Számos fág bemutatásos vizsgálat történt különféle anyagok (fémek, félfémek, kristályos anyagok és poli-1. ábra: Fág bemutatásos technika lépéseinek szemléltetése Ph.DTM-7 fág könyvtár használatával blokkolt polimer felületen merek) felületén az anyagok felületi sajátosságainak vizsgálatához [21]. Jelen munkánk célja fág bemutatásos technika vizsgálati módszer alkalmazása a modellként is használható polisztirol felületének jellemzésével. A jelenlegi kísérlet eredményei nagymértékben hozzájárulhatnak későbbi munkáinkhoz, amelyekben a fogászatban jelenleg is használt polimerek felületének jellemzését végeznénk el fág bemutatásos módszer használatával. A szintetikus polimerek felületéhez kötődő specifikus és nem specifikus aminosav szekvenciák meghatározása fág bemutatásos módszerrel közelebb vihet azon mintázatok (peptide motif), oligopeptidek megismeréséhez, amelyek részt vehetnek a kötőfelszínek kialakításában, az antigén-prezentációban, illetve az allergiás folyamatok megismerésében. Vizsgálati anyag és módszer A fág bemutatásos technikát a NEB (New England BioLabs Inc. Ipswich, MA) protokollja szerint végeztük el. A fág könyvtárban nagyszámú, egyedi változatot tartalmazó, kombinatorikus peptid, illetve fehérje található (egyedi fágokról 100 másolat fág könyvtár 10 plében). Jelen munkánkban az általunk használt 7 tagú fág könytár (Ph.DTM-7) random heptapeptidek kombinációját tartalmazta, ami az M13 fonalas bakteriofág p Vili burokfehérjéhez egy Gly-Gly-Gly-Ser flexibilis linkeren keresztül kapcsolódik. Kísérleteinket 96 lyukú polisztirol lemezen (Thermo Immulon 1B® közepes kötődésű) végeztük el háromhárom független mintával (n = 3). Negatív kontrollként a marhaszérum albumin (BSA) fehérjével blokkolt polisztirolt választottuk. A blokkolással azon peptidek kötődése gátolható, amelyek a polimer felületéhez nagyobb affinitással kötődnének. Pozitív kontroll a polisztirol streptavidin (Str) fehérjével borított felszín volt. A protokoll szerint azoknak a peptideknek, amelyek a Str fehérjéhez kötődnek, a Flis-Pro-Gln (HPQ) mintázatot kellene tartalmazniuk. A vizsgálandó minta a nem blokkolt, tiszta polisztirol volt. A fág könyvtárból hígításokat (2 x 1011 db fág / könyvtár 2 X 109 kiónnal) készítettünk, majd ráhelyeztük a megfelelően előkészített mintákra. A nem kötődő fágokat TBST-vel (Tweent tartalmazó Tris puffer) mostuk le. A kötődő fágokat a polisztirol felületről glicinnel, míg a Str borított felületről a kötődő fágokat a protokoll szerinti biotin TBS-es oldatával eluáltuk. Ezek után az F pilussal rendelkező Escherichia coli gazdasejtben (ER 2738) felszaporítottuk (amplifikáltuk) (1. ábra). Ezt a szelekciós kört egymás után háromszor végeztük el úgy, hogy az első körből tisztított, amplifikált fágokat újra, a megfelelően előkészített (Str kezelt, BSA blokkolt és nem kezelt) felületekre helyeztük. A harmadik szelekciós kör végén kapott eluált fágok hígításait a felnövesztett Escherichia coli gazdasejttel együtt LB/ IPTG/X-gal táptalajjal ellátott lemezekre öntöttük, majd
