Fogorvosi szemle, 2016 (109. évfolyam, 1-4. szám)

2016-09-01 / 3. szám

FOGORVOSI SZEMLE

109. évf. 3. sz. 2016.

77

hagytuk felnőni a kék színű plakkok megjelenéséig (37°C, egy éjszaka). A plakkok egyenként egy-egy kiónt jelentettek, amelyekből random módon 20-20 darabot kiválasztottunk. A kiválasztott kiónokat egyenként amplifikáltuk, majd az Escherichia colitól való tisztítás után kinyertük a fág DNS-ét. A DNS kinyerése és tisztítása Nal/etanolos kicsapással történt, majd az egyszálú DNS-ek koncentrációját nanodroppal (NanoDrop 1000, Thermo Scientific, USA) mértük meg. A kötőképes kiónok által hordozott gének bázis sorrendjének meghatározása -96 glll szekvenáló primer használatával történt (Macrogen Europe, Amsterdam, Hollandia).

A peptidekben az aminosavak előfordulási gyakoriságának és hidrofilicitás szempontbeli meghatározására Mega6 programot használtunk.

Eredmények

Peptid szekvenciák pozitív, negatív kontroll és polisztirol vizsgált felületen

A Str-polisztirol (Str-PS) felületéhez, a marhaszérum albuminnal blokkolt polisztirolhoz (BSA-PS) és a kezeletlen felszínű polisztirol mintához kötődő fágok által hordozott leggyakoribb aminosav szekvenciákat az 1. táblázatban összegeztük.

1. táblázat

Pozitív kontroll (Str-PS felület), negatív kontroll (BSA-PS) és polisztirol felületekről eluált leggyakoribb peptid szekvenciák. Az egyes szekvenciák mögé zárójelbe írt számok jelölik a gyakoriságot.

Streptavidinnel borított

PS felületen (pozitív kontroll)

Marha szérum albuminnal blokkolt PS felületen (negatív kontroll)

PS felületen

GLFNHPQ (3)

AGAYVAT (2)

DNKAIIN (2)

WLFNHPQ (8)

DVYSFSV (2)

FSGRPLP (8)

GWFNHPQ (2)

FARYMGD (2)

QRHMSSI (2)

FSRTLPT (2)

VSRDTPQ (3)

FSTTHPD (3)

FTRTIHT (2)

GTSTTAQ (3)

HASNAGA (3)

HSHTLTW (2)

IKSVTDW (2)

SIYGLAE (2)

TTLGVWT (4)

VGSYLGI (3)

A streptavidinnel borított felületen a WLFNHPQ szekvencia fordult elő a legnagyobb gyakorissággal. A Str-PS felületről eluált fágokban a konszenzus mintázat a HPQ tripeptid, a NEB protokolljának megfelelően. A BSA-PS felületről eluált peptidekben több konszenzus mintázat jelent meg. A legfelismerhetőbbek az FXRT, FSXT tetrapeptidek, ahol X bármilyen aminosavat jelöl. A polisztirol felületen a FSGRPLP szekvencia fordult elő a legnagyobb gyakorisággal.

Peptid szekvenciák jellemzése polisztirol felületen

A módosított polisztirol (Str-PS és BSA-PS) és a kezeletlen polisztirol felületen válogatott oligopeptidekben az aminosavak oldallánc jellege szerinti csoportosítást a 2. ábra mutatja. Az apoláros oldalláncú aminosavak a legnagyobb számban fordulnak elő mindhárom felületen. A BSA-val blokkolt és kezeletlen PS felületen az apoláros oldalláncú aminosavak közel egyforma gyakorisággal fordultak elő. A poláros oldalláncú aminosavak a BSA-val blokkolt felületen mutattak nagyobb gyakoriságot. A BSA-val blokkolt felületen 38,39%, míg a natív PS felületen 25,71% volt a poláros jellegű aminosavak megoszlása a legnagyobb gyakorisággal eluált fágokban.

A savas és a bázikus (elektromosan töltött) oldallánccal rendelkező aminosavak elmaradnak az apoláros és poláros csoportoktól. Savas jellegű aminosavak a pozitív kontroll esetében nem voltak. A bázikus karakterű aminosavak a kezeletlen PS esetében mutattak legnagyobb gyakoriságot.

Megbeszélés

A fogászatban alkalmazott fág bemutatás (phage display) technika lehetőséget ad azon oligopeptidek megismerésére, amelyek nagy affinitással kötődnek a polimerek vagy fémek felületéhez, segítve ezzel az allergia patomechanizmusának, elsősorban az antigén prezentációnak a megértését. Polimer felületen több kutatócsoport végzett fág bemutatásos technikát.

Munkánk során polisztirol felületén végeztük el a fág bemutatásos technikát, azzal a céllal, hogy megismerjük azokat a gyakori szekvenciákat, amelyek a legnagyobb affinitással kötődnek a hidrofób polimer felületéhez a kombinatorikus egyedi változatokat tartalmazó kiindulási fág könyvtárból. Pozitív kontrollként a PS felületéhez kötött streptavidin célmolekulát választottunk. Az irodalomból ismert, hogy a legfelismerhetőbb tripeptid mintázat (HPQ) ugyanazon kötődési helyen kötődik, mint a biotin. Az álalunk elvégzett kísérleti eredményekben is megfigyelhető volt a HPQ mintázat a streptavidinnel borított polimer felületen (1. táblázat). A HPQ mintázat a streptavidinkötő peptidek között ismert, de ezen mintázaton kívül is azonosíthatók olyan peptidek, amelyek a streptavidinhez kötődnek [17, 28]. Az irodalomban találtakkal összhangban [30] kísérleteinkben mi is találtunk olyan mintázatot, amely nem felétlenül csak a HPQ mintázatot tartalmazta. Egy másik, legfelismerhetőbb mintázat, a GXFN (X bármilyen aminosavat jelölhet) is előfordult a HPQ mellett (1. táblázat), amely hasonlít a GD(FA/V)XF mintázathoz, amelyet Roberts és munkatársai találtak hasonló felületen [20],