Fogorvosi szemle, 2016 (109. évfolyam, 1-4. szám)
2016-03-01 / 1. szám
30 FOGORVOSI SZEMLE ■ 109. évf. 1. sz. 2016. Mágneses mikrogyönggyel kapcsolt ellenanyaggal jelölt sejteket mágneses oszlopon izolálhatjuk (Magnetic Activated Cell Sorting - MACS) [12]. Ebben az esetben egy erős mágnesre helyezett mágnesezhető oszlopra visszük föl a sejtszuszpenziót. A jelölt sejtek az oszlopon kitapadnak, míg a jelöletlenek lemoshatok. Az oszlopot eltávolítva a mágnesről, mágnesesség hiányában a jelölt sejtek is lemoshatóvá válnak az oszlopról. Munkánk célja az volt, hogy bölcsességfog pulpájából életképes primer STRO-1 pozitív őssejteket izoláljunk, valamint összehasonlítsuk az izolálásra használható, irodalomból ismert két módszer (MACS, FACS) hatását a sejtekre. Vizsgálati anyagok és módszerek Szövetminták Munkánkhoz a Debreceni Egyetem Fogorvostudományi Karán ellátott páciensekből sebészi úton eltávolított, impaktált bölcsességfogakat használtunk, ügyelve arra, hogy olyan fogakat válasszunk, melyek nem közlekedtek a szájüreggel, illetve amelyek az eltávolítás alatt nem sérültek. A páciensek a Beleegyező nyilatkozat (F0321/1.C) aláírásával járultak hozzá eltávolított szöveteik felhasználásához. Sejtizolálás és sejttenyésztés Az irodalomban fellelhető, többféle módszer adaptálásával, kombinálásával és továbbfejlesztésével végeztük a sejtek izolálását és tenyésztését [7, 11, 13]. A bölcsességfogakat műtéti eltávolításuk után azonnal steril Hank-féle sóoldatba helyeztük. A bölcsességfogakat turbinába fogható gyémánt fisszúra fúróval vízhűtés mellett hossztengelyének megfelelően szeparáltuk, ügyelve a sterilitásra, illetve a pulpakamra és a gyökércsa-1. ábra: A pulpa eltávolítása. A pulpát steril fülkében távolítottuk el a hosszában körbevágott, majd szétrepesztett fog pulpakamrájából. torna sértetlenségére, majd a fogakat azonnal szobahőmérsékletű streptomycin-penicillinnel kiegészített steril Hank-féle sóoldatba helyeztük és a laboratóriumba szállítottuk. Lamináris fülkében steril körülmények között a vágás mentén kettérepesztettük a fogakat, majd a pulpát eltávolítottuk (1. ábra). A pulpát steril szikével földaraboltuk és egy órán át emésztettük 37°C-on, mintánként 1,5 ml, 3 mg/ml kollagenáz (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) és 4 mg/ml diszpáz (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY, USA) enzimet tartalmazó Hank-féle sóoldatban. A mintákat emésztés közben 15- 20 percenként vortexeltük, majd ezt követően 5 percig centrifugáltuk 1200 rpm-en. A felülúszót eltávolítottuk, a sejteket 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillinstreptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) és 1% GlutaMAX (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY, USA) kiegészítést tartalmazó Minimum Essential Medium Eagle Alpha modification (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) tenyésztőmédiumban szuszpendáltuk, és 25 cm2-es sejttenyésztő flaskába ültettük ki. Az izolált heterogén sejtpopulációt 37°C-os 100%-os páratartalom és 5%-os C02-tartalom mellett tenyésztettük. A sejttenyésztő médiumot hetente háromszor cseréltük. A sejtek válogatása és immuncitokémia A sejteket a második passzáláskor válogattuk. Tripszin- EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) oldattal választottuk le a sejteket a tenyésztőedényről, majd öt percig centrifugáltuk 1200 rpm-mel, végül 1% HEPES, 10% FBS tartalmú Hank-féle sóoldatban (HHF) reszuszpendáltuk. Mouse a-STRO-1 IgM (Millipore, Billerica, MA, USA) ellenanyaggal 40 percen keresztül 4°C-on jelöltük, majd háromszor mostuk HHF-fel. A másodlagos ellenanyagok Rat a-mouse IgM MicroBeads (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Németország) valamint Alexa Fluor 488 goat a-mouse IgG, IgM (H+L) (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) voltak, ezekkel szintén 40 percig, 4°C-on jelöltük a sejteket. Kísérleteinkhez három, különböző páciensektől származó fogat használtunk föl. A méréseket a három biológiailag független mintán mindhárom válogatási módszerrel egy-egy alkalommal végeztük. Az elemszám így minden válogatási módszer esetében n = 3. A MACS-hez mágnessel kapcsolt másodlagos ellenanyaggal jelölt sejteket megjelöltük fluoreszcensen jelölt másodlagos ellenanyaggal is, így három különböző csoportot vizsgáltunk: FACS, MACS és MACS-FACS. A mágneses válogatást MACS Manual Separatorral (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Németország), a fluoreszcens válogatást BD FACS Aria III áramlási citométerrel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) végeztük. A FACS válogatási kaput a csak másodlagos ellenanyaggal jelölt kontroll alapján állítottuk be. A kiválogatott STRO-1 pozitív sejteket a korábban említett médiumban és körülmények között tenyésztettük. A válogatást megelőzően és azt követően, valamint egy héttel később Bürker-kamra segítségével határoztuk meg a sejtek számát. A válogatott sejtek karakterizálására az a-STRO-1
