Fogorvosi szemle, 2016 (109. évfolyam, 1-4. szám)
2016-03-01 / 1. szám
FOGORVOSI SZEMLE 109. évf. 1. sz. 2016. 31 ellenanyaggal történt mágneses szeparálás után a sejtek egy részét 24 lyukú plétbe helyeztük (30000/lyuk) és mezenchimális (ct-STRO-1 IgM, a-CD44 IgG), illetve haematopoietikus őssejtekre (a-CD14 és a-CD19) specifikus ellenanyagokkal jelöltük a gyártó (Millipore, Billerica, MA, USA) utasításai szerint. A jelölt sejteket AxioVert A1 (Zeiss, Jena, Németország) típusú inverz fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk. Osteoblast irányú differenciálódási képesség vizsgálata A kiválogatott őssejtek egy részét osteoblast irányba differenciáltató, 100 nM dexamethasont, 0,2 nM aszkorbinsavat, 10 mM ß-glycerophosphatot (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) tartalmazó és a már említett módon kiegészített a-MEM médiumban tenyésztettük, majd három hét elteltével a sejtközötti állományban a kalciumlerakódást Alzarin Red S (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) festéssel vizsgáltuk, az alábbiak szerint. A sejteket háromszor PBS-ben mostuk, majd 30 percig metanolban fixáltuk, a metanolt leszívtuk, és öt percig szárítottuk. Ezt követően 2%-os Alizarin Red S oldattal (pH 7,0) két órán keresztül inkubáltuk. Desztillált vízzel háromszor mostuk, majd fényképezőgép (Canon EOS 60D) segítségével dokumentáltuk a kapott eredményt. Kontrollként kezeletlen sejteket használtunk. Eredmények Őssejtválogatás és válogatás utáni populációméret-változás A fogbélből kitenyésztett sejtek a szövetből származó sejtekre jellemző fibroblaszt fenotípust mutattak. A sejteket második passzáláskor jelöltük MACS-hez és FACS- hez is. A háromszor elvégzett válogatási kísérlet alapján a mágneses oszlop a kiindulási sejtmennyiségnek 1,2 ± 0,2%-át válogatta ki, ami valamivel több, mint a fluoreszcensen válogatott 0,9 ± 0,2 százalék, de a különbség nem szignifikáns (p > 0,05). A mágnessel már leválogatott majd fluoreszcensen újra válogatott sejtek aránya a kiindulási sejtmennyiséghez képest 0,5 ± 0,02%, a MACS és a FACS csoportokhoz képest is szignifikánsan kevesebb (p > 0,05) (2. ábra A). A mintákban a válogatással feldúsított őssejtek aránya ■ MACS ■ FACS ■ MACSFACS A488 fluoreszcencia intenzitás 2. ábra: Az őssejtválogatás eredménye. A) A sejtszám változása a különböző mintákban a kiindulási sejtszámhoz viszonyítva (* - szignifikáns különbség, p > 0,05). (MACS - mágnesesen válogatott csoport; FACS - fluoreszcensen válogatott csoport; MACS-FACS - mágnesesen és fluoreszcensen is válogatott csoport). B-E) Egy-egy jellemző hisztogram a jelölt és jelöletlen sejtek fluoreszcenciaintenzitás-eloszlásáról a kontroll mintában, illetve az egyes műveletek után: csak másodlagos ellenanyaggal jelölt kontroll (B), MACS válogatás után (C), FACS válogatás után (D), valamint MACS és FACS válogatás után (E).
