Fogorvosi szemle, 2008 (101. évfolyam, 1-6. szám)
2008-08-01 / 4. szám
157 FOGORVOSI SZEMLE ■ 101. évf. 4. sz. 2008. MTT-analízis 96 üregű szövettenyésztő tálca egy-egy üregébe 0,1 ml tenyésztő médiumban kb. 2000-3000 sejtet ültettünk ki, majd a tálcát 24 órára 37 °C-os, 5% C02-dal dúsított 100% páratartalmú levegőt biztosító tenyésztőszekrénybe helyeztük. A sejtek kitapadását követően a tápfolyadékot eltávolítottuk, majd egyszeri foszfát pufferes (PBS, Invitrogen, Carlsbad, California) mosást követően 24 órára üregenként 0,1 ml szérummentes a-MEM tápoldatot mértünk be a sejtciklusok szinkronizálása céljából. Ezt követően eltávolítottuk a szérummentes tápot, majd 72 órán keresztül kezeltük a sejteket. Ezután ismét 1x PBS-sel öblítettük a sejteket, majd 100-100 pl 0,2 mg/ml koncentrációjú szérummentes MTT (1-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-3,5-diphenylformazan, Sigma-Aldrich, St.Louis, Missouri) oldatot mértünk az üregekbe. A formazánkristályok kialakulásával járó színreakciót követően az MTT-oldatot pipettával eltávolítottuk, és a sejtek mitokondriumaiban NADH által redukált lila formazánkristályokat 100-100 pl DMSO (dimetil-szulfoxid, Sigma-Aldrich, St.Louis, Missouri, USA) oldatban oldottuk fel, majd szuszpendálást követően az egyes minták abszorbanciáját 570 nm-es hullámhosszon mértük le. Az MTT-vizsgálatok segítségével az FCS illetve a klinikumban parodontális regeneratív műtétek során használt [14] és PDL eredetű sejtekre igazoltan in vitro hatásokkal bíró [16] zománc mátrix derivátum (EMD) tartalmú Emdogain® (Straumann Cambridge, MA USA) kezelés hatását kívántuk vizsgálni, a gyökérhártya eredetű sejtkultúrákban. Az eredményeink statisztikai kiértékelését egyszempontos varianciaanalízissel és Bonferroni-korrekcióval korrigált t-próbák segítségével végeztük. A diagramok oszlopain a párhuzamos mérési eredmények átlagát és szórását (±SD) tüntettük fel. FACS analízis A sejttenyészetből 0,2% EDTA-t tartalmazó oldattal egysejt-szuszpenziót készítettünk, és a megfelelő antitesttel vagy izotípus-azonos negatív kontroll antitesttel 1 órán keresztül inkubáltuk jégen. A sejteket totális borjúszérum 5%-os PBS oldatával mostuk, majd ezt követően a fluoreszcens jelzőanyaghoz konjugált szekunder antitestet adtunk a mintákhoz. Fötális borjúszérum 5%-os PBS oldatával történő mosást követően a sejtszuszpenziót 4% paraformaldehid oldattal fixáltuk, végül flow-citométeren vizsgáltuk. Eredmények PDLSC sejtek izolálása és sejtkultúrában tartása, tenyésztése, klonogenitásuk vizsgálata Az impaktált bölcsességfogakból izolált PDLSC sejtek a kiültetést követő néhány órán belül kitapadtak, illetve standard tenyésztési körülmények között osztódni 1. ábra. Második passzázsbeli PDLSC sejtek morfológiája. Bal felső kép: első nap, közvetlenül tripszin-EDTA oldattal történő passzálás után, szuszpenzióban. Jobb felső kép: három órával később, a sejtek letapadtak. Bal alsó kép: 3. nap, szubkonfluens tenyészet. Jobb alsó kép: 5. nap, a tenyészet teljesen konfluens. 200x nagyítás.
