Horváth László (szerk.): Halbiológia és haltenyésztés (Mezőgazda Kiadó, Budapest, 2000)
1. Biológiai alapismeretek - 1.4 Orbán László: Molekuláris eljárások alkalmazása a haltenyésztésben
révén jöhetnek létre. A null allélek felbukkanása az adott marker heterozigozitásának alábecslését eredményezhetné, de szerencsére nem túl gyakoriak. A mikroszatellitek izolálására több lehetőség van. A leggyakrabban alkalmazott eljárás egy genomikus génkönyvtár létrehozásán és az abban való „halászáson” alapul. A könyvtárból az adott ismétlődés(eke)t jelölt próbaként használva a mikroszatel- liteket tartalmazó sejtek (kiónok) hibridizálással kiválaszthatók. A sejtekből izolált vektorba illesztett szakasz bázissorrendjének megállapítását követően az ismétlődéssorozatot közrefogó szekvenciákra a primerek megtervezhetők, így az adott régió specifikusan felsokszorozhatová válik. Azon fajoknál, ahol a genom bázissorendjét (szekvenciáját) kellő hosszúságban meghatározták (pl. ember, egér) számítógépes programok segítségével is kikereshetők az ismétlődések, majd az azokat két oldalról határoló primerek azonnal megtervezhetők. A halak közül egyedül a Fugu rubripes-bői azonosítottak így mikrosza- telliteket, mivel az emberi sejtekben tárolt teljes genetikai információ megismerését célzó, ún. Humán Genom Programban modellállatként használják. A többi halfaj ge- nomjáról nem áll rendelkezésre elegendő információ ehhez a megközelítéshez. A mikroszatellitek felsokszorozására használt primerek hibridizálhatnak ún. konzervatív genomrégiókra, melyek az evolúció évmilliói alatt sem változnak. Az ilyen primerek nemcsak abban a fajban használhatók, melyből leírták őket, hanem sikerrel alkalmazhatók közeli, sőt néha még távoli rokonságban levő fajokban is. Az eddig vizsgált fajok genomjának analízise arra enged következtetni, hogy a halak mikroszatellit markerei szignifikánsan hosszabbak az emlősökénél. További vizsgálatok szükségesek annak eldöntésére, hogy ez a halak általános jellemzője-e vagy inkább csak néhány faj specifikus tulajdonsága. A mikroszatellit markereknek számos előnye van: kodomináns módon öröklődnek, kimutatásuk specifikus reakcióval történik, magasfokú polimorfizmust és heterozigozi- tást mutatnak. Hátrányuk ugyanakkor az izolálás nagyobb munka- és időigénye, és az a tény, hogy a genomot egy ponton tesztelik, ezért egy egyed analíziséhez több PCR reakcióra van szükség. Utóbbi probléma enyhíthető az ún. multiplex PCR reakciók kifejlesztésével, melyekben primer párok együttes alkalmazásával egyszerre több marker genotipizálható. A multiplex reakciók alkalmazásának két feltétele van: 1. a primerek képesek legyenek egymás jelenlétében is működni; 2. az egy reakcióban felsokszorozott markerek alléljeinek mérettartománya ne fedjen át. Amennyiben az első feltétel nem teljesül, de a második igen, úgy a mintákat a PCR reakció elvégeztével is össze lehet vonni, és ugyanazon a gélen elválasztani. Fordított esetben a primereket különböző fluoreszcens festékekkel jelölve átfedő mérettartományú termékeket is sikerrel detektálhatunk. Változékony genomrégiók hosszpolimorfizmusa A sejtmagi és mitokondriális genom konzervatív18 szakaszai kiváló kiindulási alapot nyújtanak markerek keresésére. Igen elterjedt módszer az ún. EPIC-PCR (Exon- Primed Intron-Crossing PCR) mely egy adott gén két szomszédos exonjának végéről 18 A genom azon régiói, melyek az evolóció folyamán igen kevéssé változnak, elsősorban maguk a gének vagy esetleg egyes vezérlő régiók. 154
