Horváth László (szerk.): Halbiológia és haltenyésztés (Mezőgazda Kiadó, Budapest, 2000)
1. Biológiai alapismeretek - 1.4 Orbán László: Molekuláris eljárások alkalmazása a haltenyésztésben
kiindulva sokszorozzuk fel a közöttük lévő változékony intront. Amennyiben a reakció egy adott család vagy rend több fajából izolált DNS-sel is működik, és a kapott termék hosszpolimorfizmust mutat (fajonként eltérő méretű), a molekuláris taxonómia céljaira ideális eljárást kapunk. Természetesen az eljárás nem csak két szomszédos exon közötti intronok, hanem géneket összekötő szakaszok analízisére is alkalmas lehet. Mára a kereskedelemben kaphatók olyan primer párok, melyekkel jó esély- lyel foghatunk hozzá egy új faj vagy éppen hibridek molekuláris analíziséhez. PCR-RFLP és pontmutációk analízise Ha a PCR reakcióban kapott termék hossza a két vagy több faj esetében nem tér el, még mindig van esély a különbségtételre a felsokszorozott szakasz RFLP analízisével. Az eljárást, mely a PCR-RFLP nevet kapta, előszeretettel alkalmazzák mtDNS anali- zisére. A PCR-RFLP jóval hatékonyabb eljárás elődjénél, az RFLP-nél, mert a szelektív felsokszorozás feleslegessé teszi a hibridizálást. Ráadásul az egy reakcióban felsokszorozott DNS szakasz mennyisége meglehetősen nagy, így több restrikciós enzim párhuzamos alkalmazásával az RFLP markerek viszonylag gyorsan azonosíthatók. A fel sokszorozott szekvencia bázissorendjének meghatározása vagy a fragmentek speciális géleken történő elválasztása a vizsgált szakasz bármely pontján előforduló pontmutációk (egy bázispár megváltozását nevezzük így) kimutatását is lehetővé teszi. így jóval több polimorfizmus mutatható ki, mint a restrikciós enzimek felismerési helyéhez kötött RFLP eljárással. RAPD analízis A RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) a PCR egy speciális formája, ahol rövid19, véletlenszerűen megválasztott bázissorrendű primereket és alacsony feltapadási hőmérsékletet (35-40 °C) alkalmazva elérhetjük, hogy a genom több, számunkra ismeretlen szakaszát egyszerre szaporítsuk fel. A RAPD reakcióban a genomnak csak azon szakaszairól képződik detektálható mennyiségű termék, ahol a primer a DNS két szálára megfelelő közelségben20 képes feltapadni, hiszen a sokszorosításnak előfeltétele, hogy a képződött egyszálú DNS végéről a következő ciklusban az ellenkező irányban indulhasson meg a láncépítés (29. A) ábra). A reakció befejeztével a termékeket tartalmazó oldatot gélelektroforézisnek alávetve a keletkezett DNS fragmentek elválaszthatók: a kapott ffagmentlétra nagyon hasonló az elektromos pénztárgépek által leolvasott vonalkódokhoz (29. B) ábra), melyet az áruk azonosítására használnak. A csíkmintázat egyes csíkjai a vizsgált faj (család vagy populáció) minden egyedében megjelennek, azaz monomorfok, míg mások csak egyes egyedekben vannak jelen, másokból hiányoznak, azaz polimorfok, az utóbbiak alkalmazhatók markerként. 19 Általában 6-10 bázis hosszúságú, szemben az átlagos PCR-nél használt 20-30 bázissal. 20 Többnyire 3-5 kb., de speciális reakcióban egy nagyságrenddel hosszabb szakaszok is sokszorozhatok. 155
