Szemészet, 2016 (153. évfolyam, 1-4. szám)

2016-03-01 / 1. szám

Morphological characterises of cell damage

Bevezetés

A szürkehályog magas incidenciájú, multifaktoriális, elsősorban időskorhoz kötött szemészeti megbetegedés. A szemlencse anyagcsere-zavarának következtében annak fényáteresztő képessége csökken, az egyedüli megoldás ennek eltávolítása. Több műtéti megoldás is létezik, hiszen a szürkehályog-sebészet a phacoemulsificatio megjelenése óta is jelentős változáson ment át. Néhány éve femtoszekundum lézeres technikát is alkalmaznak, amelynek során a szemlencsét fedő elülső lencsetokon a CCC-t nem manuálisan, hanem lézer segítségével végzik. Ennek a technológiának

2001-ben történt bevezetése drámaian megváltoztatta a refraktív sebészetet, és széles körben kezdték használni az in situ lézer keratomileusis kapcsán (5, 10). Napjainkban a kataraktasebészet célja a közel emmetropia elérése. A femtoszekundum lézeres technológiával végzett mindig kerek, pontos méretű és centrális CCC könnyen reprodukálható, egyszerűbb a műlencse centrálása, ezért is tartják biztonságosabbnak (2). Egy klinikai tanulmány szerint a hátsó lencsetok elhomályosodásának incidenciája 50% feletti, a műtéti technikák fejlődésének ellenére (8). A másodlagos szürkehályog valószínűleg az extrakapszuláris katarakta-extrakció utáni reziduális epithelsejtek migrációjának és proliferációjának köszönhetően alakul ki.

Nagyon keveset tudunk azonban arról, hogy milyen elváltozások alakulnak ki az elülső lencsetok epithelsejtjeiben a manuális, illetve a femtoszekundum lézeres capsulotomia után, hiszen a legtöbb klinikai tanulmány fókuszpontjában a vágási felszín, a műlencse decentrálódása, a felhasznált lézerenergia áll (3, 6, 7). Maye.r is munkatársai szerint (2014) az eltávolított elülső lencsetok vágási felszínén található epithelsejtek különbözőképpen érintettek annak függvényében, hogy lézeres vagy manuális CCC történt. Az apoptózis detektálására alkalmas TUNEL-módszerrel jelölt

epithelsejtek a lencsetok vágási felszíne mentén arra engednek következtetni, hogy az apoptózis több sejtet érint femtoszekundum lézeres capsulotomia során, mint az elülső lencsetok manuális eltávolítása esetén (4).

Feltételezhető ugyanakkor, hogy a sejtek érintettsége nemcsak a vágási felszínen, hanem távolabb is eltérő lehet a két eltérő típusú CCC következtében.

Jelen tanulmányban ezért fénymikroszkópos és ultrastrukturális morfológiai elváltozások vizsgálatát végeztük az eltávolított elülső lencsetokok epithelsejtjeinek magjában, citoplazmájában kialakuló változásokra összpontosítva.

Anyag és módszerek

Minták: Manuális és femtoszekundum lézerrel (VICTUS® Femtosecond Laser, Bausch + Lomb USA) eltávolított elülső lencsetokokat vizsgáltunk (n=26). A manuálisan eltávolított elülső lencsetokokat az

I. csoportba (n=12), míg a femtoszekundum lézeres capsulotomiákat a II. csoportba (n=14) soroltuk.

Morfológia

vizsgálata

Immunhisztokémia A mintákat, a műtéti eltávolítás után azonnal 4%-os foszfát pufferben oldott (PB, 0,1 M, pH 7,4) formaldehiddel (Sigma, Budapest, Magyarország) fixáltuk. A p53 expressziót immunhisztokémiai módszerrel vizsgáltuk, a következők szerint: a szöveteket TRIS-pufferben (0,1 M, pH 7,4) történő mosást követően, a p53 fehérje ellen nyúlban termelt poliklonális antitest (Santa Cruz Biotechnology USA) 1:50 hígításban alkalmazott oldatában, szobahőmérsékleten egy éjszakán át inkubáltuk. Ezután mintáinkat 2 órán át az elsődleges antitestnek megfelelő, fluorophorral konjugált szekunder antitesttel (Alexa Fluor® 488 anti-nyúl, 1: 100, Lifetechnology, Budapest, Magyarország) inkubáltuk. Ezt követően került sor a magfestésre 4',6-diamidino-2-phenylindollal (DAPI, 1:1000; Sigma, Budapest, Magyarország), majd Fluoromount-G-vel (Southern Biotech, USA) lefedtük a mintákat.

A megfestett mintákból konfokális lézerpásztázó mikroszkóppal (Fluoview FV-1000, Olympus, Japán) felvételeket készítettünk. A kontrollmintánkban az elsődleges antitestet kihagytuk, és a szekunder antitestekkel való keresztreakciót kizártuk.

Transzmissziós elektronmikroszkópia A frissen kivett lencsetokokat 2%os PB-vel pufferolt formaldehid és 2,5%-os glutáraldehid oldatban előfixáltuk (0,1M pH=7,4) 24 órán át 4 °C-on. Ezt követően a mintákat PB-ben oldott 1%-os ozmium-tetroxid oldatban 30 percig szobahőmérsékleten utófixáltuk. A fixálást követően az elülső lencsetokokat emelkedő koncentrációjú alkohollal víztelenítettük. Ezután rövid mosás (2x2 perc), majd propilén-oxid kezelés következett, és a mintákat Durcupan műgyantába ágyaztuk be. A beágyazott mintákat ultramikrotómmal metszettük (Leica Ultracut R, Leica). A félvékony metszeteket toluidin-kékkel festettük, majd fénymikroszkóp segítségével vizsgáltuk. Emellett ultravékony, 50 nm vastag metszeteket is készítettünk, amelyeket rácsos gridekre vettünk fel, majd uranilacetát és ólom-citrát oldatával kontrasztoztuk és JEOL TM 1000 transzmissziós elektronmikroszkóp segítségével vizsgáltuk.

Adatok kvantifikálása és statisztikai analízis A degenerálódott sejtek arányát mindkét csoportban a toluidin-kékkel festett félvékony metszeteken határoztuk meg Olympus BX 50 Mikroszkóp segítségével. A teljes vastagságú szöveti mintán 40x-es objektív használata mellett az öszszes sejtet, és a degenerálódott sejteket megszámoltuk, majd a degenerálódott morfológiájú sejtek arányát meghatároztuk. A DAPI-val

16