Szemészet, 2006 (143. évfolyam, 1-4. szám)
2006-12-01 / 4. szám
143. évfolyam (2006) 215 expresszálódott. A lumikán erősen festődött az epitheliumban, míg eloszlása a normál és az excimer lézerrel kezelt cornea stromájában nem mutatott különbséget. Knock-out egérmodellek A proteoglikánok cornealis kollagénszintézisben betöltött szerepének tisztázására heterozigóta és homozigóta knockout (génkiütött) egérmodelleket hoztak létre.3’4,10 Megfigyelték, hogy a dekorin-, biglikán-, fibromodulin- és lumikán-null egerek közül kizárólag a homozigóta lumikán knock-out egér corneája vesztette el transzparenciáját. A Saika és kutatócsoportja által létrehozott modellben a hátsó stromában figyelték meg a kollagénrostok szabálytalan méretét és elrendeződését, továbbá az elhúzódó hámosodást az epithelium mechanikus eltávolítása után.16 Párhuzamosan Chakravarti munkacsoportja2,3,4 is kifejlesztett egy lumikán gén knock-out egérmodellt. Vizsgálataik során az egerek bőrének nyúlékonyságát mérték, mely szignifikánsan eltért a vad típusú kontrollállatok bőrének nyúlékonyságától. Megfigyeléseik szerint a knock-out fenotípus emlékeztet az Ehler-Danlos-szindróma bizonyos formáira. A homozigóta mutáns állatokon kétoldali corneaopacitást írtak le a születés utáni 4-5. héten. Mivel a corneájuk kezdetben tiszta volt, feltételezhető, hogy a lumikán nem játszik szerepet a cornea kialakulásának korai embrionális fázisában, viszont elengedhetetlenül szükséges a posztnatális érése során a megfelelő kollagénfelépítéshez. Transzmissziós elektronmikroszkóppal elemezve a bőrben és a corneában abnormálisán vastag kollagénrostokat találtak. A fibrillumok megfelelő elrendeződése és az interfibrilláris rések hiánya szembetűnő volt. A szövettani vizsgálatok a szívbillentyűk kóros fejlődését is kimutatták. In vivo konfokális mikroszkópos vizsgálatok megerősítették az eredményeket.2 Egy másik kutatócsoport megvizsgálta a lumikán hiányának hatását a sclerában. A homozigóta mutáns egerek vastagabb kollagénrostjai a sclerában a corneához hasonlóan szabálytalan lefu-1. ábra. Cornealis subepithelialis homály (Hanna-skála szerint H-2,0) a PRK-kezelés után egy évvel tást mutattak. Az egerek szemének mérete megnövekedett, alakja megnyúlt. Chakravarti3 munkacsoportjának legújabb modellje egy lumikán-fibromodulin két génhiányos, „double null” egér. A mutáns állatok bulbushossza szignifikánsan nagyobb, a szövettani vizsgálat a sclera elvékonyodását és helyenként a retina leválását mutatta ki. Ez a modell megfelel a myopiás fenotípus modelljének. Következésképp ezen proteoglikánok megváltozott expressziója vagy mutációja szerepet játszhat a myopia kialakulásában. Kutatásunk célja a két jelölt gén, a lumikán és a keratokán, csírasejtes mutációi szerepének tanulmányozása volt humán anyagon az előbbiekben összefoglalt állatkísérletes eredmények alapján. Betegek és módszer A Semmelweis Egyetem I. Szemészeti Klinikáján 1994 és 2002 között fotorefraktív keratectomiával (Mel 70, Zeiss Meditec, Jéna, Németország) kezelt betegek közül azt a betegcsoportot vizsgáltuk, amely kóros sebgyógyulást mutatott és a corneahomály mértéke Hanna szerint >1,0 volt egy évvel a műtét után (1. ábra).9 A pre- és posztoperatív klinikai vizsgálat magában foglalta a nyers és korrigált látásélesség, a szemnyomás, a corneatopográfia (Torney, TMS-1) és a corneavastagság meghatározását ultrahangos pachiméterrel (Humphrey Model 855, San Leandro, USA), valamint a biomikroszkópos vizsgálatot. A cornealis subepithelialis homály mértékét egyazon vizsgálóorvos (NZZ) határozta meg a Hanna által leírt beosztás szerint.9 A tanulmányban 7 férfi és 3 nőbeteg vett részt, átlagéletkoruk 33,3 év (18-45 év) volt. Átlagos preoperatív fénytörési hibájuk -8,5±2,3 D szférikus ekvivalens (-4,75----14,0 D szférikus ekvivalens), az átlagos ablációs mélység 88,94±18,64 pm (56-130 pm) volt. Kontrollként két, PRK-műtéttel kezelt, normális cornealis sebgyógyulást mutató páciens véréből származó DNS-t vizsgáltunk. A vizsgálatok az Egészségügyi Tudományos Tanács Tudományos Kutatásetikai Bizottsága által engedélyezett kutatási terv alapján, a Helsinki Deklarációnak megfelelően folytak. Valamennyi résztvevő írásbeli beleegyező nyilatkozatot írt alá a részletes tájékoztatás után. A perifériás vér leukocytáiból genomiális DNS-t izoláltunk (Wizard Genomic DNA Purification Kit, Promega, Madison WI, USA), majd primertervezés után polimeráz láncreakció révén (Termo Hybaid PxE thermal cycler, Thermo Hybaid, Franklin MA, USA) amplifikáltuk a lumikán és keratokán gének 5’-át nem íródó régióját magában foglaló 1. exont, illetve a fehérjét kódoló 2. és 3. exonokat. A lumikán gén esetében a PCR- termékek DNS-szekvenciájának meghatározásához automata szekvenálást Ш E 1 23456789 C A G T T G T TG T T C C OQOOOOOOO 2. ábra. A keratokán gén mutációanalízise. (A) előszűrés poliakrilamid gélen, a nyilak a megváltozott futási mintázatra mutatnak a 2. oszlopban. (B) a talált eltérés verifikálása szekvenálással, a nyíl a heterozigóta polimorfizmusra (G/T) mutat A PROTEOGLIKÁNOK SZEREPE A CORNEALIS SEBGYÓGYULÁSBAN - A LUMIKÁN ÉS A KERATOKÁN GÉNEK MUTÁCIÓANALÍZISE
