Szemészet, 2002 (139. évfolyam, 1-4. szám)
2002-03-01 / 1. szám
139. évfolyam (2002) 37 sára Novocastra NCL-RB monoklonális antitestet használtunk (higitás: 1:10). Az antigén-antitest reakció megjelenítése Vectastain ABC kittel történt (Vector, USA). Neuronspecifikus enoláz Abban az esetben, melyben nem volt egyértelmű, hogy a vizsgált sejtek valóban tumorsejtek, a malignus sejtek kimutatására a neuronspecifikus enoláz (NSE) detektálását végeztük el. Az immunhisztokémiai reakció kivitelezéséhez 5 pm vastag metszeteket készítettünk a szemből. Megfelelő előkezelést követően a nem specifikus antitestkötődés kizárására egér anti-NSE (1:50 Dako USA)-vel inkubáltuk a mintákat. Az antigén-antitest reakciót biotinált anti-egér IgG-vel (1:200 Vector, USA) és 1:40 hígítású TexasRed streptavidinnal (Vector USA) tettük láthatóvá. A sejtmagokat DAPI-val jelöltük.6 Eredmények Kétoldali retinoblastomás betegek Négy esetben más intézményben végezték az enucleatiót, így nem volt vizsgálható tumormintánk, de a gyermekek és szüleik perifériás vére hozzáférhető volt. Hat betegnél rendelkezésünkre álltak a tumorból nyert sejtek és a gyermekek és a szülők véréből preparált lymphocyták. Egy esetben csak a daganatból nyert sejteket tudtuk vizsgálni, mert a vérvételhez a szülők nem járultak hozzá. Kísérleteink során a FISH-analízist először a tumorsejteken végeztük el. Ha FISH-el deléciót találtunk az RB1 génre nézve, azaz nem volt fluoreszkáló jel a 13q 14 lókuszon bekövetkezett deléció miatt, a beteg véréből preparált 1. táblázat. A kétoldali retinoblastomás esetek eredményei A FISH mindkét alléit jelöli A FISH egyik alléit sem (tumor), vagy csak az egyik alléit (vér) jelöli Tumorsejtek 3 4 Beteg lymphocytái 6 1 Szülő lymphocytái 7 0 Kísérleteink során a FISH-analízist először a tumorsejteken végeztük el. Ha FISH-el deléciót találtunk az RB1 génre nézve, azaz nem volt fluoreszcens szignál, a 13q 14 lókuszon bekövetkezett deléció miatt, a beteg véréből preparált lymphocytákat is hibridizáltuk az RB1 génre specifikus próbával. Abban a három esetben, ahol nem volt FISH-el kimutatható allélvesztés, a perifériás lymphocytákat nem vizsgáltuk. A tumorban a bilaterális esetekben vagy mindkét alléi FISH-el kimutathatóan elveszett, vagy ezzel a módszerrel nem volt detektálható az allélvesztés. Betegeink közül egynek a perifériás lymphocytáiban is jelentkezett az allélvesztés, amikor ezt kimutattuk, még a másik szemben nem volt daganat (ez a betegünk került a féloldali csoportból a kétoldaliak közé). Mivel a második szemben nagyon nagy volt a daganat megjelenési valószínűsége, gyakori kontrollvizsgálatokat alkalmaztunk és a második szemben megjelent daganatot sikerült kis méret mellett felfedezni és kezelni. * * t » 1. ábra. Sejttenyészetben az interfázisú sejtekben egy-egy jelölődés látható a 13ql4 lókusz-specifikus próbával. Az oszló sejtekben 1 kromoszómán az adott jelöléssel ép viszonyokat találunk a másik kromoszóma nem jelölődik a lókusz-specifikus próbával lymphocytákat is hibridizáltuk az RB1 génre specifikus próbával. A bilaterális esetekben nyert eredményeinket az 1. táblázat mutatja. Abban a három esetben, amelyeknél nem volt FISH-el kimutatható allélvesztés, a perifériás lymphocytákat nem vizsgáltuk. A tumorban a bilaterális esetekben vagy mindkét alléi FISH-el kimutathatóan elveszett, vagy ezzel a módszerrel nem volt detektálható az allélvesztés. Betegeink közül egynek a perifériás lymphocytáiban is jelentkezett az allélvesztés (1. ábra), amikor ezt kimutattuk, még a másik szemben nem volt daganat (ez a betegünk került a féloldali csoportból a kétoldaliak közé). Mivel a második szemben nagyon nagy volt a daganat megjelenésének valószínűsége, gyakori kontrollvizsgálatokat alkalmaztunk és a második szemben megjelent daganatot sikerült kis méret mellett kezelni. Féloldali retinoblastomás betegek Összesen nyolc féloldali retinoblastomás beteg eltávolított szeméből nyert tumor sejteket vizsgáltunk. (Egy korábban ebbe a csoportba tartozó beteget már a kétoldaliak között említettünk). Öt esetben rendelkezésünkre állt a tumor, a beteg és a szülők perifériás lymphocytái, három esetben pedig csak a daganat. A 13ql4 génre vonatkoztatva FISH- el a féloldali eseteket összefoglaló 2. táblázatban látható eredményeket kaptuk. Ugyanannak a betegnek a tumorsejtjeiben és a perifériás lymphocytáiban is csak egy alléi elvesztését mutattuk ki FISH-el. Tekintettel arra, hogy a génfunkciónak a daganat kialakulásához el kellett vesznie, ez egyben a retinoblastoma-fehérje expressziójának a hiányát is jelenti. Szövettani metszeteket készítettünk a korábban általunk kettévágott szemből, ezekben a metszetekben retinoblastoma-fehérjét nem tudtunk kimutatni, az NSE pozitivitás igazolta, hogy tumorsejteket vizsgáltunk.18 Mind-MOLEKULÁRIS GENETIKAI VIZSGÁLATOK RETINOBLASTOMÁS BETEGEKEN
