Szemészet, 2002 (139. évfolyam, 1-4. szám)
2002-03-01 / 1. szám
36 Szemészet mástól független mutáció eredménye egy új retinoblastoma megjelenése. Az örökletes retinoblastomában szenvedő betegek esetében az egyik mutáció familiáris prediszpozíció eredménye, míg a második intrauterin alakul ki. Létrejöttének ideje meghatározza a tumor egy- vagy kétoldali jellegét.412 Az öröklött defektus az utód minden sejtjében megtalálható. Ez magyarázhatja, hogy a kétoldali betegségben szenvedőkön gyakori a szekunder tumorok (pl. osteosarcoma) manifesztálódása.1 A retinoblastoma 1 gén (RB1) terméke egy foszfoprotein (pRB), amely transzkripciós faktorok (pl. E2F) szabályozásában vesz részt. így gátolja egy géncsoport aktiválódását, és ezzel a sejt proliferációját. Ennek hiányában a sejtben a G/O-G/l átment lehetővé válik és a sejtproliferáció megindul, gátlás hiányában kontroll nélkül.13 A sporadikus és herediter retinoblastomadaganatok elkülönítése genetikai módszerekkel lehetséges. Tekintettel arra, hogy az RB1 génben ún. forró pontok nincsenek, a gén mérete miatt a részletes genetikai analízis hosszadalmas (27 exon PCR-analízisét kell megvalósítani). FISH-el lehetőség van a kilobázis szintű deléciók kimutatására és ezzel bizonyos esetekben a gyors diagnosztizálásra is. A fluoreszcencia in situ hibridizáció alkalmas specifikus DNS-szekvenciák megjelenítésére, morfológiailag ép kromoszómákon, sejteken és szövetekből készült metszeteken. Minden olyan sejt vagy szövet tanulmányozható, melyben a DNS nem degradálódott, ill. melyben a degradáció nem indult el. Jelenleg a FISH a leggyorsabb molekuláris genetikai módszer a kromoszomális eltérések kilobázis szintjén történő kimutatására. Pinkel és Gray 1988-ban dolgozta ki a fluoreszcencia detektálásán alapuló in situ hibridizációt.7 A specifikus DNS-szekvenciák kimutatása in situ hibridizációval a DNS azon tulajdonságán alapul, hogy megfelelő denaturálási körülmények között (pH, hőmérséklet, kémiai környezet) a DNS kettős spirál szerkezete megbomlik és így az ugyancsak denaturált DNS-próbák számára hozzáférhetővé válik.7'10,16 A renaturáció során (37 °C, pH 7,0, optimális kémiai környezet) a DNS-próba szekvenciájának megfelelő komplementer nukleinsavszekvenciáját felismeri a target DNS-ben és hozzákötődik. A jelzett DNS-próbák rövid (200-500 bázispár hosszúságú) hisztokémiai úton detektálható, nukleotid prekurzorral (biotin, digoxigenin stb.) jelölt DNS-fragmentek.7 A közvetlenül fluorofórral konjugált nukleotidokkal (pl. fluoreszcein-dUTP vagy TexasReddUTP) a genetikai eltérések detektálás ideje lényegesen lerövidül,710'6 Hibridizációt követően a DNS specifikus próba szekvenciájának megfelelő kromoszómaszegmenteken normál sejtek hibridizációját követően egy-egy fluoreszkáló jel, míg az interfázisos sejtmagokban két fluoreszkáló pont jelenik meg. A legelterjedtebben alkalmazott centroméra-specifikus próbák a számbeli eltéréseket, míg a lokusz-specifikus próbák a nevükben jelzett célpontot azonosítják. A DNS-specifikus 13q 14 próba az RB1 gén jelentős részét lefedi, biztosítva ezzel a próba alkalmazhatóságát RB1 -deléció kimutatására.2 Betegek és módszerek 1989-1997 között 11 kétoldali retinoblastomás betegen végeztünk molekuláris genetikai vizsgálatokat Szemklinikánkon. A hét fiú és négy lánybeteg életkora 3 hónap és három év közötti volt a kezelések megkezdésekor. Az egyik szem enucleatióját követően ruténium-applikátoros kezelést végeztünk a második szemen.3,5 Ebbe a csoportba tartozó négy beteg az egyik szem eltávolítását követően érkezett klinikánkra, a második szem kontakt irradiációs (applikátor) kezelésére. így az eltávolított szem daganatából nem állt rendelkezésünkre minta, csak a betegek, ill. szüleik véréből. 1989-1997 között féloldali retinoblastoma miatt enukleált kilenc betegen végeztünk molekuláris biológiai vizsgálatokat. A hét fiú és két lány életkora 3 hónap és 4 év közötti volt. Egyik féloldalinak induló 3 hónapos betegünk később a kétoldali csoportba került, így összesen nyolc beteg (7 fiú és 1 lány) tartozott a féloldali csoportba. Mind a bilaterális, mind a féloldali tumoros betegek családi anamnézise negatív volt a retinoblastomát tekintve. A részletes és családi anamnézis felvételét követően a szülők, testvérek szemészeti vizsgálatát valamennyi esetben elvégeztük. Egyik esetben sem találtunk szemfenéki eltérést. Kísérleteink során a tárgylemezen fixált interfázisú sejteken alkalmaztuk a fluoreszcencia in situ hibridizációt.6,10 A módszert retinoblastomadaganatból enucleatiót követően frissen vett interfázisú tumorsejtekre kellett megfeleltetni. A tumorból származó sejtek kinyeréséhez rendelkezésünkre álló protokollt adaptáltuk kis térfogatú szövetből nyerhető interfázisos sejtekre, hiszen a tumornak csak igen kis részlete állt FISH-analízisre rendelkezésre. A daganatból sejtszuszpenziót készítettünk, melyet fixálást követően zsírtalanított tárgylemezre cseppentettük, hagytuk megszáradni, majd a tárgylemezeket -20 °C-on tároltuk.10 A hibridizációs eredmények kiértékelhetőségének megkönnyítésére a fenti módon nyert lemezeken a fixált tumorsejtekre (az első hibridizációs eredmények ismeretében) egészséges egyedből származó lymphocytákat cseppentettünk. Valamennyi hibridizációt háromszor ismételtük meg és minden alkalommal párhuzamosan normál sejtek hibridizációját is elvégeztük. Amennyiben a tumorban FISH-el eltérést találtunk, a gyermek és a szülők perifériás véréből, szülői beleegyezést követően, lymphocytákat preparáltunk, majd a már említett fixálás után a kicseppentett mintákat tárgylemezeken -20 °C-on tároltuk. Kontrollként egészséges egyedekből származó perifériás vérből kromoszómapreparátumot készítettünk standard protokoll szerint. A centroméra-specifikus próbák egy része digoxigeninnel jelzett,6 a másik része pedig biotinált DNS-próbák voltak. A lokusz-specifikus DNS-próbák (13q 14) direkt jelzett, a VYSYS cég által forgalmazott minták.6 Retinoblastoma-protein (pRB ) kimutatása Minden olyan tumornál, amikor FISH-el mindkét 13ql4 lókusz detektálható volt, azaz deléciót nem tudtunk kimutatni és a szövettani blokk rendelkezésünkre állt, 5 pm vastag szöveti metszeteket készítettünk. Kontrollként humán embrionális porcszövetet alkalmaztunk.6 A pRB kimutatáDamjanovich Judit