Szemészet, 2002 (139. évfolyam, 1-4. szám)
2002-03-01 / 1. szám
Szemészet erőteljes gátló hatást fejt ki az SR Ca2+-pumpára és lassítja a Ca2+-felvételt.4'5 A foszfolambant különböző proteinkinázok (cAMP-függő, Ca2+/kalmodulinfüggő) jól foszforilálják és a beépült foszfátcsoport felfüggeszti az SR Ca2+-ATP-áz enzimre gyakorolt gátló hatást. A foszforiláció a foszfolamban hidrofil citoplazmatikus domain részén történik, a cAMP-függő proteinkináz a Ser-16 aminosavat, a Ca2+/kalmodulinfüggő proteinkináz a Thr-17 aminosavat foszforilálja.4 A foszfolamban által médiáit gátlás felfüggesztése drámai módon fokozza az SR Ca2+-felvételét, ami együtt jár a myocardium, a simaizom, illetve a lassú, oxidativ vázizmok relaxáció sebességének gyorsulásával. A fokozódó Ca2+-felvétel miatt növekszik az izmok kontraktilis funkciója is. Patológiás körülmények között (hyperthyreosis, hypothyreosis, cardialis dekompenzáció bizonyos formái, simaizom elfajulással járó kórképek) módosul az SR Ca2+-ATP-áz aktivitása és/vagy szöveti mennyisége, valamint módosulhat a foszfolamban mennyisége is.4 A pajzsmirigyhormonok direkt módon megváltoztatják a foszfolamban és az SR Ca2+-ATP-áz szöveti expresszióját és részben ezen fehérjék (SR Ca2+-ATP-áz és foszfolamban) arányának módosulásával magyarázzák a hypo- és hyperthyreosisban kialakuló markáns eltéréseket az izmok kontraktilis és relaxációs funkciójában.9 Kevés adat áll rendelkezésre a humán extraocularis szemizmok Ca2+-anyagcseréjéről (normál vagy patológiás körülmények között), jóllehet ezen izmok speciális szerepet töltenek be, és funkció szempontjából típusosán lassú, oxidativ rostoknak tekinthetőek. A jelen közleményben megvizsgáltuk: 1. normál extraocularis humán szemizomban az SR Ca2+-ATP-áz és foszfolamban szöveti mennyiségét, 2. patológiás körülmények között (strabismus okozta atrophiás állapot) ugyanezen fehérjék szöveti jelenlétét. Mindezek a vizsgálatok adatokat szolgáltathatnak az extraocularis szemizmok Ca2+-anyagcseréjéről, illetve a Ca2+-anyagcsere szabályozásában bekövetkező patológiás eltérésekről strabismusban. Anyag és módszer A vizsgálatokhoz szükséges szövetmintákat egyéb szemészeti indikáció miatt elvégzett bulbuseltávolítás során nyertük. A strabismus korrekciójából származó minták az elongált (atrófiás) rectus medialis vagy rectus lateralis műtéti resectiójából származtak. Az izomszövetből való mintavétel minden esetben a beteg írásbeli hozzájárulásával történt. 14 A vizsgált specifikus fehérjék szétválasztását - teljes szövethomogenizátumból (kvantitatív western-blot segítségével) - immuno-blot technikával végeztük.9 Primer ellenanyagként konvencionális antitesteket használtunk (PHLAb, SRCA-Ab, Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, USA). Az egyes fehérjék szétválasztásra 10-20%-os SDS gradiens poliakrilamid gélt alkalmaztunk. A PHL-Ab ellenanyagot 1:1000 hígításban, a SRCA-Ab ellenanyagot 1:500 hígításban alkalmaztuk. Az előhívás (vizualizálás) alkalikus foszfatázzal konjugált egér-ellenes másodlagos antitestekkel (Amersham, Arlington Heights, USA), a kiértékelés Phosphorimager (ImageQuant program) segítségével történt. A foszfolamban mennyiségének meghatározásához az in vitro utófoszforilációs technikát is alkalmaztuk.6 Ennek lényege, hogy cAMP-függő proteinkináz katalitikus alegységgel, [y-32P]ATP jelenlétében a foszfolambant teljes mértékben foszforiláltuk (proteinfoszfatáz-gátló NaF jelenlétében). A beépült foszfát radioaktivitása arányos a foszfoprotein szöveti mennyiségével. A fehérjéket 10-20%-os SDS gradiens poliakrilamid gélen választottuk szét. A radioaktív jelöltség meghatározásához konvencionális autoradiográfiát és folyadék-szcintillációt használtunk. Az eredményeket pmol [32P]/mg protein, illetve pixel érték/mg protein egységekben fejeztük ki. A fehérjemeghatározáshoz Peterson11 módszerét használtuk. A statisztikai elemzéshez kiszámítottuk az átlagot és a szórást (S.D.). A kiértékelést a t-próba segítségével végeztük, szignifikánsnak a p<0,05 eltérést tekintettük. Eredmények Az utófoszforilációs és western-blot vizsgálatok egyértelműen azonosították a foszfolambant az extraocularis szemizmok membránfrakciójában (1., 2. ábra). A foszfolambannak megfelelő 26 kDa sáv (pentamer) az SDS gélelektroforetikus mintapufferben végzett forralás hatására disszociálódott alacsonyabb molekulasúlyú fragmensekre (10 kDa). Ez a jelenség: a disszociáció majd a lehűlést követő reasszociáció, egyértelműen azonosítja a polipeptidláncot (csak a foszfolambanra jellemző). Mind az utófoszforiláció, mind a kvantitatív western-blot adatai alapján a foszfolamban mennyisége szignifikánsan csökkent a strabismus műtété során eltávolított rectus lateralis és medialis mintákban a kontroll normál izomszövet értékeihez képest (1. táblázat). Az SR Ca2+-ATP-áz elleni antitest egyértelműen csak a SERCA2 fehérjére volt specifikus, ezért adataink ennek az izoenzimtípusnak a jelenlétét igazolták. A SERCA1 izoen-1. táblázat. A strabismus hatása a foszfolamban és az SR Ca2+-ATP-áz szöveti szintjére Utófoszforiláció Western-blot Foszfolamban/ SR (pmol [32P]/mg protein) PL В (pixel/mg protein) PLB SR Ca2+-ATP-áz Ca2+-ATP-áz hányados Kontroll 23.4±3,0 133±18 244±21 0,55±0,12 Strabismus 15,8±2,8* 94±12* 113±17* 0,83+0.15* *p<0,05 Facskó Andrea
