Szemészet, 1993 (130. évfolyam, 1-4. szám)
1993-05-01 / 2. szám
Szemészet, 130 (1993) 65—69 A Szent-Györgyi Albert Orvostudományi Egyetem Szemészeti Klinika (igazgató: Süveges Ildikó) közleménye In vitro sebgyógyulásmodell cornea endothel sejttenyészetben (Immunhistochemiai és scanning elektronmikroszkópos tanulmány) Mohay Judit, Süveges Ildikó A szerzők kísérleteikben sertés cornea endothel sejttenyészet morfológiai és immunhistochemiai jellemzőit vizsgálták sebgyógyulásmodellben és kontrolltenyészetekben. A cornea endothel sejtek minden esetben fibroblast contaminatiotól mentes monolayert alkottak. A nem sebzett sejttenyészetekben csak enyhe vimentin pozitivitás volt jellemző, míg a sebzett endothel monolayerben a vimentin expressio jellegzetességei megváltoztak, valamint fibronectin immunreakció is megjelent. Egy esetben a sebzést követően az egész tenyészet gyors fibroblast transzformációja következett be. Eredményeikből arra következtetnek, hogy a sebgyógyulás során nemcsak az endothel sejtek extracellularis mátrixhoz való viszonya, hanem az intracellularis cytoskeleton konstelláció önmagában is megváltozik. Kulcsszavak: cornea, endothel, sejttenyészet, immunhistochemia, vimentin, fibronectin Wound healing model in pig corneal endothelial cell culture (An immunohistochemical and scanning electron microscopic study) In this study, non injured and injured pig corneal endothelial cell culture were examined by immunohistochemistry and scanning electron microscopy. 7 primary corneal endothelial cell culture was established in petri dishes, contained coverslips. Endothelial cells migrated from the explants within 7 days and growth became confluent by 22 days. On the 5th day after the second passage a 4 mm2 wound was scraped in the center of the cultured endothelial sheet on the surface of coverslips. 24 and 72 hours later the cells were stained with Giemsa and treated by monoclonal antivimentin and polyclonal anti fibronectin (Dako, Dakopatts, Denmark) and also examined by scanning electron microscopy. In all cases the cultured cells formed a monolayer without fibroblast contamination. The non-injured cultures expessed only mild vimentin positivity, while in injured corneal endothelial cell cultures we found the changing in characteristic of vimentin immunostaining and the appearence of fibronectin. In one culture, in the wounded area elongated cells and the rapid transformation of the whole culture to fibroblasts cells appeared. Keywords: cornea, endothelium, cell culture, immunhistochemistry, vimentin, fibronectin Bevezetés A szaruhártya endothelium felelős a cornea transparentia fenntartásáért. Károsodása az elülső segmentet érintő bármely betegség, sérülés kapcsán bekövetkezhet és súlyos látásromláshoz vezet. Fontos ismernünk tehát a cornea endothel sejtek regenerációjával kapcsolatos intra- és extracellularis mechanizmusokat úgy in vivo, mint in vitro körülmények között. Sok közleményben olvashatunk állatkísérletekben végzett, az endothel sebgyógyulását tanulmányozó modellekről [2, 18]. Bár a cornea endothelium proliferatios készsége rendkívül különböző lehet az egyes speciesekben [11,19, 20], a sejtek viselkedése a cornea hátsó felszínén alkalmazott mechanikus sebzést követően mégis hasonló. Az endothel sejtek megnagyobbodnak, denzitásuk csökken, heterogenitásuk nő, a sejtmag helyzete megváltozik [1, 2, 18]. Gordon [2, 3] és mtsai vizsgálták az extracellularis matrix komponensek viselkedését mechanikus sebzést követően patkány cornea endothelben in vivo, de ezen komponensek in vitro tulajdonságairól már lényegesen kevesebbet tudunk. Vannak ismereteink a tenyésztett endothel sejtek markereiről [19], cytoskeletalis jellemzőiről [14], de nem ismerjük ezek szerepét, változását kóros körülmények között. Kísérleteink célja a sertés endothel sejttenyészet morfológiai, funkcionális és immunhistokémiai tanulmányozása volt normális és patológiás körülmények között. Anyag és módszer 8 hónapos sertésszemekből steril körülmények között metszettük ki a szaruhártyát, majd Trypsin 0,125%-os és EDTA (ethylen-diamin-tetra-acetate) 0,1%-os oldat keverékével kezeltük 10 percig. Az oldat hatását cc. Fetal Calf Serummal állítottuk le, majd a corneák perifériás részének megfelelően az endothel réteget mechanikus úton eltávolítottuk. Az explan tokát tápfolyadékba helyeztük. A tápfolyadék összetétele: Dulbecco Modified Eagle Medium, 15% Fetal Calf Serum (GIBCO), 1000 mg D-Glucose/1, 3 mg/ml L-Glutamine, 1 mM Napyruvate, valamint 100 NE/ml Penicillin, 100 microgramm/ml Streptomycin. A tenyészeteket olyan Petri-csészékben (Nunclon, Denmark) helyeztük el, 7z77 Fedő lemez + expiant Petri csésze + medium Cornea-endothel monolayer 7*7 /*7 /*7 1. ábra. A Petri-csésze felszínén növekvő sertés cornea endothel sejtek ún. monolayert alkotnak. A tenyészet a chrom-alu-zselatinnal kezelt fedőlemezeket is teljesen fedi. Ez utóbbiak alkalmasak az immunperoxidase reakció és a scanning beágyazás elvégzésére.
