Szemészet, 1993 (130. évfolyam, 1-4. szám)
1993-05-01 / 2. szám
66 Szemészet, 130 (1993) amelyek mindegyike chrom-alu-gelatinnal kezelt üveg fedőlemezeket tartalmazott. Ezek a lemezek - felszínükön az endothel monolayerrel - képezték később a mintát az immunhistokémiai reakciók és a scanning elektronmikroszkópiás beágyazás elvégzéséhez (1. ábra). Az endothel tenyészeteket 5% СОг-t tartalmazó termosztátban helyeztük el 37 °C-on, szigorúan steril körülmények között. A sejtnövekedést naponta inverz mikroszkóp segítségével kísértük figyelemmel. A confluens tenyészeteket Trypsin-EDTA-oldat felhasználásával passzáltuk. A második passage-t követő 5. napon a monolayeren konstans területű (4 mm2) sebzést ejtettünk steril tűvel a fedőlemez közepén. 24 és 72 óra múlva a lemezeket Giemsával festettük, és elvégeztük az immunhistokémiai reakciókat. Az anyag egy részét scanning elektronmikroszkópos vizsgálathoz ágyaztuk be (2. ábra). Az immunhistokémiai reakciókhoz peroxidase-anti-peroxidase módszert alkalmaztunk, a primer ellenanyag monoclonalis anti-vimentin intermediaer filamentum protein IgG(l), ili. polyclonalis anti-fibronectin (DAKO/Dakopatts Denmark) volt. A sejttenyészeteket az immunreakciók elvégzése előtt 300 ml methanol, 150 ml ecetsav és 50 ml chloroform elegy oldatával fixáltuk. A scanning elektronmikroszkópiához a tenyésztett sejteket Karnowsky-oldatban rögzítettük, 1%-os osmium tetroxiddal utánfixáltuk, a dehydralást követően kritikus hőmérsékleten szárítottuk, majd platina-arany ötvözettel fedtük. /7/7/77 f=3 Fedő lemez + expiant Petri csésze + medium Cornea-endothel monolayer i I \ /Z7 77 /7 2. ábra. A második passage-t követően 4 mm2-es sebzést ejtettünk a fedőlemezek közepén. 24h és 72h múlva a tenyészeteket Giemsával festettük, elvégeztük az immunperoxidase reakciót és a scanning elektronmikroszkópiás beágyazást. Eredmények Az endothel sejtek növekedése és migrációja 7 vizsgált cornea közül 4 esetében egy héten belül megindult. Az endothel sejtekre az ún. „clusteri’-képződés, polygonalis alak, és kissé excentrikusán elhelyezkedő spheroid sejtmag volt jellemző (3. ábra). A kultúrák 22 nap múlva váltak confluenssé. A 4 sikeres, növekvő tenyészetet a 4. passage-ig sikerült fenntartani. A 2. és 3. passage-t követően igen sok magoszlás és sejtosztódás volt megfigyelhető. A sejtek a confluens tenyészetben minden esetben Ф 3. ábra. Praeconfluens stadium. Polygonalis sejtek, excentrikus bab alakú sejtmagokkal. Sok magoszlás. Giemsa 25 x 4. ábra. Confluens endothel monolayer. Tipikus „lépesméz” alakzat Giemsa 12,5 x 5. ábra. Confluens cornea endothel monolayer scanning elektronmikroszkópos képe egyetlen réteget alkottak, a tipikus, endothel sejtekre jellemző lépesmézalakzatot felvéve (4. ábra). Fibroblast contaminatiót nem tapasztaltunk. A sejtek morfológiája a fedőlemezeken és a Petri-csésze felszínén teljesen egyezett. A scanning-felvételeken szintén megfigyelhető volt az összefüggő endothel monolayer (5. ábra).
