203982. lajstromszámú szabadalom • Eljárás újszülött borjak Rotavírus és Escherichia coli mikroorganizmusok okozta hasmenéses megbetegedése elleni inaktivált, adjuvált, bivalens oltóanyag előállítására
1 HU 203 982 B 2 amely a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében az NCAIM B (P) 001098 szám alatt került letétbe helyezésre. A törzset felhasználásig fagypont alatti hőmérsékleten tároljuk. A felhasználásra kerülő törzset szilárd táptalajon szaporítjuk és K99 savóval ellenőrizzük. Inokulum készítése: Módosított Minca táptalaj előállítása 1,36 g kálium-dihidrogénfoszfátot, 10,1 g dinátrium-dihidrogénfoszfát-dihidrátot, 1,0 g Trypcasin peptont (Humán gyártmánya), 5,0 g élesztő-kivonatot (Oxoid), 1,0 g glükózt és 1,0 ml nyomelem oldatot (összetétele: 10 g kristályos magnézium-foszfát, 1,0 g kristályos mangánklorid, 0,135 g ferriklorid-hexahidrát és 0,4 g kristályos kalciumklorid desztillált vízzel 1000 ml-re oldva) desztillált vízben feloldunk és 1000 ml-re kiegészítünk. A táptalaj kémhatása pH=7,5 legyen. Egy 500 ml-es állólombikba 300 ml módosított Minca táptalajt szűrünk steril körülmények között. A lombik tartalmát 37 °C-ra melegítjük, majd az ST+ K99 E. coli törzs 16-20 órásnál nem régebbi agar tenyészetéből 1-2 kacsnyi mennyiségével beoltjuk és 16-20 órán át, 37 °C hőmérsékleten, rázógépre helyezve tenyésztjük. A tenyésztési idő letelte után tisztasági vizsgálatot végzünk sziláid (agar) táptalajra való oltással. A tisztasági vizsgálatot az oltástól számított 24 óra elteltével értékeljük ki mikroszkópos vizsgálattal. A kiértékelés befejezéséig a tenyészetet 2-4 °C hőmérsékleten tároljuk. A bakteriológiailag tiszta tenyészetet használjuk fel az inokulum tenyésztés következő lépcsőjéhez. Sterilizált üvegfermentorba 7-8 liter módosított Minca táptalajt szűrünk steril körülmények között. A feimentor tartalmát 37 °C hőmérsékletűre melegítjük, majd az előzőek szerint elkészített lombik-inokulumot a táptalajhoz adagoljuk. A fermentorban történő szaporítást 37 °C hőmérsékleten, 101/perc térfogatáramú levegő bevezetésével 6 órán át végezzük. A szaporítási idő letelte után a fermentor tartalmát 10 literes, sterilizált lombikokba szívatjuk. Mikroszkópos bakteriológiai tisztaságvizsgálat után, a teljesen tiszta, csak E. coli baktériumokat tartalmazó inokulum használható további feldolgozásra. Tenyészet előállítása Sterilizált fermentorba 105 liter módosított Minca táptalajt szűrünk steril körülmények között. A táptalajt 37 °C hőmérsékletűre melegítjük és 7-8 liter, előzőek szerint elkészített inokulummal beoltjuk. Kevertetés mellett, félintenzív levegőztetéssel (0,2 bar túlnyomással) 6-7 órán keresztül végezzük a fermentálást. A fermentáció ötödik órájában steril körülmények között mintát veszünk, annak tisztaságát mikroszkópos vizsgálattal minősítjük. A szaporodás mértékéről spektrofotometriásán, 720 nm-es szűrővel győződünk meg. A szaporodás befejeződött, ha a hatodik órában vett minta a fény 15-20%-át engedi át és az ötödik órában mért értéknél nem kisebb. A 2,5 x 109 csíraszámú fermentlé a nyúlban termelt anti K99 savóval 2-3 percen belül meghatározva négykeresztes agglutációt kell hogy mutasson. A hatodik órában vett mintából szilárd táptalajra felkenünk és mikroszkópos vizsgálatot is végzünk. A bakteriológiailag tisztának minősített tenyészethez inaktiválás céljából 1%-os vizes mertiolatoldatot adunk olyan mennyiségben, hogy a mertiolat végkoncentrációja 1:10000 legyen. Ezt követően 37 °C hőmérsékleten, levegőztetés nélkül, 30 percig kevertetjük a tenyészetet A mertiolat-oldattal inaktivált tenyészetet steril üvegbe fejtjük és 48 óra múlva sziláid táptalajra és lósavós levesbe üvegenként oltjuk, és 72 óra múlva meggyőződünk az inaktiválás hatásáról. Csak az az inaktivált fermentlé használható fel, amelyből semmiféle idegen baktériumtelep kinövése nem tapasztalható. Pílusantigén elválasztás Az előzőek szerint előállított inaktivált és ellenőrzött fermentlevet centrifugálással (3000/perc fordulaton 60 percen keresztül) 25 x 109 csíraszámra koncentráljuk. A tömény szuszpenziót 5 percen keresztül 15 000/perc fordulaton működő Ultra-Turrax (IKÁWerk) berendezéssel nyíróigénybevételes kezelésnek vetjük alá. A kezelés közben az anyag nem melegedhet fel 25 °C hőmérséklet fölé. A kezelés során a baktériumtestek felszínéről letőredezett pílust ismételt centrifugálással elválasztjuk a baktériumtesttől. A centrifugálás után a baktériumtesttől mentes felülúszó folyadékban a pílus mennyiségének gyors meghatározása ismert módon, fehérje meghatározással történik. Vakcinakészítésre a 0,2 mg/ml fehérjetartalmú felülúszó fázis használható fel. Vírusantigén komponens előllílása [b) összetevő] Az eljárásban hasmenéses tünetek között megbetegedett újszülött borjakból izolált, H. C. S. jelű vírustörzset használunk fel, amely a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében az NCAIM V (P) 001099 szám alatt került letétbe helyezésre. Vírustörzsanyag előállítása A tömeges vírusszaporodáshoz szükséges törzsanyagot -70 °C hőmérsékleten tárolt vírustörzsből állítjuk elő. A vírustörzset 2000 ml-es Roux palackokban, MA-104 jelű majomvese sejtvonalon szaporítjuk el. Növesztő tápfolyadékként 8%-os kolosztrummentes borjúsavót tartalmazó Hanks-oldatot (Bakács-Farkas: Orvosi virológia, Medicina, Budapest 1965, 129-130) használunk. A teljes egészében benőtt egyrétegű sejttenyészetről, amely a 2-3-ik napon következik be, a tápfolyadékot leöntjük, a tenyészeteket tripszintartalmú foszfáttal pufferolt (0,4 ml 5%-os tripszin-oldat 100 ml PBS-ben) sóoldattal kétszer öblítjük. A tenyészeteket -70 °C hőmérsékleten tárolt, palackokként 10 ml törzsvírussal beoltjuk, majd tripszint tartalmazó Earie-oldatot (0,1 ml 5%-os tripszin-oldat 1000 ml Earle-oldatban) adunk hozzá. A rotavírusra jellemző citopatogén hatás megjelenése és a fertőzött sejtek 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
