203982. lajstromszámú szabadalom • Eljárás újszülött borjak Rotavírus és Escherichia coli mikroorganizmusok okozta hasmenéses megbetegedése elleni inaktivált, adjuvált, bivalens oltóanyag előállítására
1 HU 203 982 B 2 leválása után, amely a 24-36 óra között következik be, a palackok tartalmát egyedileg learatjuk. A szövetoltó törzsanyag akkor alkalmas tömeges antigéntermelésre, ha a szokásos táptalajokon (húsleves, Tarozzi leves, agar) 10 napon át végzett tisztasági vizsgálat során sterilnek bizonyul és az MA-104 jelű majomvese sejtvonalon legalább lO^/ml infektív titert ér el. Az ily módon előállított oltóvímst-20 °C hőmérsékleten tároljuk. A vírusantigén előállítása A vírusantigént az előzőekben leírtak szerint kezelt MA-104 jelű majomvese sejtvonalon állítjuk elő, 2000 ml-es Roux-palackokban. Az összenőtt tenyészeteket a tripszines PBS-sel történt öblítés után lO^TCIDjo/ml szövetoltó vírust tartalmazó tripszines Earle-oldattal fertőzzük. A palackokat 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 24 óra múlva, amikor a jellegzetes sejtkárosító hatás megjelenik, illetve a sejtek leválása 90%-os, a palackokat -20 °C hőmérsékleten kétszer fagyasztjuk, illetve olvasztjuk, majd a felülúszó folyadékot összeöntjük és -20 °C hőmérsékleten tároljuk. Sterilitás ellenőrzése A leszüretelt vinisszuszpenzió sterilitását 10 napon át vizsgáljuk 37 °C és 20 °C hőmérsékleten, a már ismertetett táptalajok felhasználásával. A vírusszuszpenziónak sterilnek kell lennie és a majomvese sejtvonalon mért infektív titemek legalább lO’TCIDjo/mlnek kell lennie. Inaktiválás előtt a vírusanyagtól a durva sejttörmeléket szűréssel elkülönítjük, inaktiválás céljából 400 pg/ml etilén-imint adunk hozzá, majd 24 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Ártalmatlansági vizsgálat A vinisszuszpenzió inaktiválódását sejttenyészet oltásával ellenőrizzük. A tömény és 1:10 arányban hígított antigén 0,2 mlnyi mennyiségével csőben kialakított MA-104 jelű majomvese sejtvonalon tenyészetet oltunk. A tenyészetek felülúszó folyadékát 3 nap elteltével ismételten tovább oltjuk. A tenyészeteken citopatogén hatás nem jelentkezhet Az oltóanyag előállítására csak a steril és ártalmatlan vírusantigén használható fel. (A Hanks-, Earle-oldatokat és a PBS-t a Bakács-Faricas: Orvosi Virológia, 1965,129-30. oldalakon ismerteti.) Amennyiben a komponensek [a) és b)] bakteriológiailag nem tiszták, illetve nem sterilek, azok nem javíthatók és oltóanyag előállítására alkalmatlanok. Ha a vinisszuszpenzió infektív titere a kívántnál alacsonyabb, akkor magasabb titerű szuszpenzió hozzáadásával felhasználásra alkalmas vírustiterű szuszpenzióvá alakítható. Ha az inaktivált vinisszuszpenzió citopatogén hatást mutat úgy további inaktiválószer hozzáadása szükséges. Az oltóanyag előállítása Egy térfogategység pilusantigén komponenst [a) komponens] öt térfogategység vírusantigén komponenssel [b) komponens] összekeverünk, majd hat térfogategység olajos adjuvánsot adunk hozzá. Az olajos adjuváns összetétele: Span 80 (ATLAS) 7 tf%, Span 20 (ATLAS) 2 tf%, Tween 60 (ATLAS) 6 tf%, Marcol 52 olaj (ESSO) 85 tf%. Az összetevők steril körülmények között való összekeverése után kapott oltóanyagot 4 °C hőmérsékleten tároljuk. Az oltóanyag 5-5 ml-es adagjával a teheneket vemhességük idejének utolsó harmadában 3 hetes időközzel kétszer kell oltani úgy, hogy a második oltást követően 2 hét teljen el az ellésig. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás újszülött boijak Rotavirus és Escherichia coli mikroorganizmusok okozta hasmenéses megbetegedés elleni adjuvált, inaktivált, bivalens oltóanyag előállítására egy baktériumtörzs és egy vírustörzs felhasználásával, azzal jellemezve, hogy a) komponensként egy fermentációs úton előállított Escherichia coli baktériumtörzs inaktivált tiszta tenyészetének koncentrálásával, a sejtek mechanikus roncsolásával és centrifugálásával pilusantigént választunk el, , b) komponensként előkezelt majomvese sejtvonalon tenyésztett Bovin Rotavirus vírustörzs összenőtt tenyészetének tripszines kezelésével pQusantigént állítunk elő, a vírusantigént tartalmazó oldatot steril körűimé^ nyék között inaktiváljuk, ' majd az a) vírusantigén komponenst, és a b) vírusantigén komponenst 0,5-2,0:3,0-8,0 arányban elegyítjük és adjuvánst adunk hozzá. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Escherichia coli baktériumtörzsként a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében az NCAIM B (P) 001098 számon letétbe helyezett Escherichia coli ST+ K99 törzset használjuk fel. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Bovin Rotavirus vírustörzsként hasmenéses tünetű újszülött borjakból elkülönített H. C. S. jelű, a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében az NCAIM V (P) 001099 számon letétbe helyezett Bovin Rotavírust használjuk fel. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vírustörzset MA-104 jelű majomvese sejtvonalon szaporítjuk el. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy adjuvánsként olajos adjuvánst alkalmazunk. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a majomvese sejtvonal előkezelését tripszinnel végezzük. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az E. coli baktériumtörzs inaktiválását nátrium-etil-merkuri-tioszalicilát vizes oldatával végezzük. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vírusantigén inaktiválására etilén-imint alkalmazunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
