203906. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a merszacidin nevű új antibiotikum és sói és hatóanyagként e vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 203 906 B 2 4. példa Y-85,54728 tenyésztése fermentorban 1. lépés Oltótenyészet előállítása rázott lombikban A 3. példa (a) lépése szerinti összetételű tápközeg 100 ml-ét 500 ml-es Erlenmeyer-lombikba helyezzük, és pH-értékét a sterilezés előtt 6,8-ra állítjuk. A lombikot 121 ‘C-on 20 percen keresztül autoklávban sterilezzük, lehűtjük és egy kacs 2. példa szerint előállított, jól szaporodó tenyészettel beoltjuk. A lombikokat 28±1 °C-on 24 órán keresztül rázatjuk körkörös rázógéppel, 220 fordulat/perc sebességet alkalmazva. Az így kapott tenyészetet használjuk a kis fermentor beoltására, az alábbiakban ismertetett módon. 2. lépés Oltótenyészet előállítása kis fermentorban 10 liter 3. példa (a) lépése szerinti tápközeg pH-értékét 6,8-ra állítjuk, és 0,04 térfogat% Desmophennel kiegészítve 15 literes rozsdamentes acél fermentorba helyezünk, és 121 ‘C-on 36 percen keresztül autoklávban sterilizáljuk, majd lehűtjük, és 4 térfogati 1. lépés szerint előállított oltótenyészettel aszeptikus körülmények között beoltjuk. A tenyésztést 24 órán keresztül folytatjuk az alábbi körülmények között: hőmérséklet: 28±1 ‘C keverési sebesség: 150 fordulat/perc levegőztetés: 6 liter/perc A 24 órás tenyészetet használjuk a 3. lépésben a tápközeg leoltására. 3. lépés Merszacidin fermentálása 100 liter 3. példa (a) pontja szerinti összetételű tápközeget, amelynek pH-értékét sterilizálás előtt 6,8-ra állítjuk, 0,06% Desmophennel kiegészítve 150 1-es fermentorba helyezünk, vagy 250 liter fenti tápközeget 0,06% Desmophennel 390 1-es fermentorba helyezünk, és 28 percen keresztül 121 °C-on sterilezzük, majd beoltjuk 4% 4. példa 2. lépése szerint előállított oltótenyészettel. A tenyésztést az alábbi körülmények között végezzük: hőmérséklet: 28±1 ”C keverési sebesség: 80-100 fordulat/perc levegőztetés: 501/óra (1501-es fermentorban) 125 1/óra (3901-es fermentorban) tenyésztési idő: 66 óra. Az antibiotikum képződését Staphylococcus aureus 209 P, Staphylococcus aureus R 85 és Alcaligenes faecalis elleni aktivitásprofillal követjük nyomon. A tenyészlevet a fermentáció leállítása után centrifugáljuk, és az antibiotikumot a felülúszóból az alábbiakban ismertetett módon izoláljuk és tisztítjuk. 5. példa Merszacidin izolálása és tisztítása A kb. 100 liter fermentléből a micéliumot centrifugálással elválasztjuk. A kapott felülúszót (pH 6,8— 7,0) 5 literes Diaion HP-20-oszlopra visszük. Az oszlopot ezután 50 1 ionmentes vízzel mossuk. Ezt kővetően egymás után 40 1 70% vizet tartalmazó metanollal, 50 1 50% vizet tartalmazó metanollal és 50 1 30% vizet tartalmazó metanollal mossuk és a mosófolyadékokat elöntjük. Az oszlopot ezután 10 1 metanollal eluáljuk. A biológiai aktivitást mutató eluátumokat csökkentett nyomáson bepároljuk. A kapott barna olajos anyagot 1 liter petroléterben (forráspontja 40- 60 ‘C) felvesszük, szűrjük, és a szűrletet elöntjük. A fenti eljárást addig ismételjük, míg szűrési maradékként port kapunk. A fenti módon 12 g nyers merszacidint kapunk, bamássárga por formájában. A nyers merszacidint 300 g szilikagéllel (0,050- 0,074 mm) töltött 5,5*53 cm-es üvegoszlopon közepes nyomású folyadékkromatográfiás eljárással tisztítjuk. Az oszlopot 1,5 1 acetonitrillel mossuk, majd 16 ml/perc átfolyási sebesség mellett 3 1 10%-os vizes acetonitrillel és 3 1 15%-os vizes acetonitrillel eluáljuk. 250 ml-es frakciókat szedünk, és 210 nmen UV-abszorpcióval, valamint mikrobiológiai módszerrel vizsgáljuk. A 15%-os vizes acetonitrillel eluált frakciókból 6 frakció (1,5 liter) mutatott aktivitást, ezeket a frakciókat vákuumban 35 ‘C-on bepárolva eltávolítjuk az acetonitrilt, majd fagyasztva szárítjuk. 2 g féltiszta terméket kapunk, sárgás por formájában. Az így kapott félig tiszta anyagot ismét közepes nyomású folyadékkromatográfiás eljárásnak vetjük alá, szilikagéllel (0,050-0,074 mm) töltött 4*54 cmes üvegoszlopon. Az oszlopot egymás után 1 liter 5%-os vizes acetonitrillel és 4,5 liter 10%-os vizes acetonitrillel eluáljuk, 30 ml/perc átfolyási sebesség mellett. 250 ml-es frakciókat szedünk, és 210 nm-en UV-abszorpcióval, valamint mikrobiológiai módszerrel vizsgáljuk. A merszacidint 750 ml 10%-os vizes acetonitriles eluátum tartalmazza, az eluátumot csökkentett nyomáson, 35 ‘C-on koncentráljuk, és fagyasztva szárítjuk. Ily módon 593 mg merszacidint kapunk, fehér - fehéres színű por formájában. A merszacidin végső tisztítását nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással végezzük, 4*250 mm-es Hypersil (10 (i)-oszlopon, eluálószerként 30%-os vizes acetonitrilt használtunk, az átfolyási sebesség 1,0 ml/perc. A frakciókat 210 nmen UV-abszorpció mérésével vizsgáljuk. A fenti körülmények között a merszacidin retenciós ideje kb. 3,5 perc. A megfelelő frakciókat összegyűjtjük, vákuumban 35 *C-on bepároljuk, majd végül liofilizáljuk. 275 mg antibiotikumot kapunk, fehér por formájában. A merszacidin tisztaságát 4*120 mm-es APS-Hypersil (5 |i)-oszlopon vizsgáljuk, eluálószerként acetonitril és víz 70:30 térfogatarányú elegyét használjuk, az átfolyási sebesség 1 ml/perc, a papír sebessége 10 mm/perc, a detektálást 210 nm-en végezzük. Az 1. ábrán látható a nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással kapott kromatogram. A merszacidin fizikai-kémiai tulajdonságai A merszacidin új vegyület, amelynek szerkezetére jellemző egy C-terminális vinil-amid-maradékot tartalmazó nonadekapepetid, és négy intramolekuláris szulfid-híd. A fizikai-kémiai állandókat az 1. táblázatban foglaljuk össze. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
