203795. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS azonosítási vizsgálatok elvégzésére és tesztanyagként használható polinukleotidok előállítására
1 HU 203 795 B 2 zését kiterjesztettük az előbbiek alapján származtatott további ismétlődő szekvenciákra is, lásd pl. kifejezett „core"- szekvencia (következő definíció). Kifejezett „core"-(szekvencia) Olyan „core”-szekvencia, amely teljes hosszában pontosan megegyezik a (2)—(8) képletekkel megadott szekvenciák valamelyikével. %-os homológia Két szekvenciarészlet összehasonlításakor azon bázispárok számát, melyeket az egyik szekvenciában ki kell cserélni, hogy pontosan megkapjuk a másikat, kivonjuk az összes bázispárok számából, s a kapott eredményt az összes bázispárok százalékában adjuk meg. A nukleotid (nt) és bázispár (bp) kifejezéseket azonos jelentéssel használjuk. Mindkettő vonatkozhat DNS-re és RNS-re egyaránt. A C, A, G, T rövidítéseket a hagyományos módon, a következő értelemben használjuk: C-(dezoxi)citidin, A-(dezoxi)adenozin, G-(dezoxi)guanozin, T»(dezoxi)timidin vagy uridin. Ezek alapján tehát a tandemismétlődő szekvencia (akár mesterséges, akár természetes eredetű) lehet tökéletes ismétlődés is, de jellemzőbben pontatlan ismétlődés. Jellemezőén legalább két ismétlődés a konszenzus-„core”-szekvencia pontatlan ismétlődése. A hibridizációs próba jellemezőén legalább három ismétlődést tartalmaz, és még jellemezőbben legalább hetet. A hibridizációs próba előállítása történhet egy természetes miniszatellit-szekvencia izolálásával, klónozás és DNS- szekvenálással történő azonosítás útján. Az előállítás magában foglalhatja a kívánt „core”-szekvencia kivágását és tandemismétlődéssé alakítását. Pontatlan ismétlődések kialakulását úgy segíthetjük elő, ha az eljárás során különböző eredetű „core”-szekvenciákat építünk össze. Az eljárást a kialakított polinukleotid klónozását is magában foglalhatja. Másrészt, a felépítő lépés magában foglalhatja az azonosított konszenzus-„core”-szekvenciának, vagy valamely fragmentumának szintézisét is. A konszenzus-„core”szekvencia jellemzőén nem kevesebb mint 6 bázispárt, és jellemzőén nem több mint 16 bázispárt tartalmaz. A szintetikus „core”-szekvenciából ezután tandemismétlődéseket hozunk létre. Természetesen a kialakított polinukleotid a jól és kevésbé jól használható köztitermékek klónozását követő különböző időben végrehajtott műveletek sorozatának lehet eredménye, és tartalmazhat mind természetes, mind szintetikus eredetű fragmentumokat is, így lehet, hogy végül meglehetősen csekély hasonlóságot mutat az eredeti miniszatellit-fragmentummal. A találmány tárgyát képező hibridizációs próbák a következő területeken hasznosíthatóak: 1. Emberi apasági és anyasági vizsgálatok. 2. Családcsoport-azonosítás, pl. bevándorlási és örökösödési viták eldöntése. 3. Egy-, vagy többpetéjűség eldöntése ikreknél. 4. Emberi vérfertőzés kimutatása. 5. Általános emberi családfavizsgálatok. 6. Öröklődő emberi betegségekért felelős lókuszok azonosítása, ami lehetővé teszi a genetikai hiba kimutatására alkalmas specifikus hibridizációs próbák kialakítását 7. Törvényszéki orvostan a) nemi erőszak áldozatául esett nőkből származó ondóminták azonosítása genetikai „ujjlenyomat”-készítéssel, b) beszennyezett ruháról, vagy máshonnan származó vér-, haj- és ondóminták azonosítása, genetikai ujjlenyomat-készítéssel, c) emberi maradványok azonosítása. 8. Kimérasejtek tanulmányozása, pl. a recipiens-sejtek donorsejtek elleni reakciójának vizsgálata, csontvelőátültetés után. 9. Haszonállat-tenyésztés és pedigrévizsgálat, hitelesítés. (Például állati törzsek genetikai tisztaságának rutinellenőrzése, és pedigrévizsgálat versenyló-, és kutyatenyésztéssel kapcsolatos peres ügyekben.) A módszer szolgáltathat olyan genetikai markert, ami kapcsoltan öröklődik valamely gazdaságilag hasznos tulajdonsággal 10. Állati sejttenyészetek minőségi rutinellenőrzése, a sejtvonalak genetikai tisztaságának vizsgálata, sejtvonalak azonosítása. 11. Különböző daganatok és daganatos sejtek vizsgálata, molekuláris rendellenességek kimutatása. 12. Várható, hogy a találmány táigyát képező oligonukleotidok, vagy a belőlük előállított hibridizációs próbák hasznosak lehetnek a növénytermésztésben is. Az ábrák rövid leírása: Az 1. ábrán a mioglobingén 33 bázispáros ismétlődő szekvenciájának plazmidban történő klónozását láthatjuk sematikus ábrázolásban. A 2. ábrán különböző próbákhoz hibridizáló genomi DNS-fragmentumokról készített autoradiogrammról készített fénykép fotókópiáját látjuk. Az ábra bemutatja azoknak a rokonoknak a családfáját is, akiknek a DNS- vizsgálatáról készült az autoradiogrammok közül kettő. A 3. ábra olyan autoradiogrammokat mutat be, melyeket három - nem rokon - embertől származó DNS- minta három különböző - a találmány tárgyát képező - próbával történő hibridizációjával állítottak elő. A 4. ábra olyan autoradiogrammokat mutat be, melyeket kilenc különböző embertől származó DNS-mintáknak a találmány tárgyát képező egyik próbával történő hibridizációjával állítottak elő. A kilenc ember közül néhányan rokonok, kettő közülük pedig egypetéjű iker. Az 5. ábra 2 emberi és 17 állati eredetű DNS-minta - találmány tárgyát képező próbával történő - hibridizációjáról készült autoradiogrammot mutat be. A 6. ábra egy bevándorlási vitában érintett ghánai család tagjaitól származó DNS-mintákból, a találmányban leírtak szerint készített autoradiogrammokat mutat be. A 7. ábra egy neurofibromatózist hordozó család tagjaitól származó DNS-mintákról készített autoradiogrammokat mutat be. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 605 6
